低分子量肝素注射液人体药效学生物等效性研究一般考虑

General considerations for the pharmacodynamics endpoint bioequivalence study of the low molecular weight heparin injection

来源

中国临床药理学杂志 第34卷 第23期 2018 年12 月

作者

陈立勋，李丽，韩鸿璨，许文频，华尉利，杨进波

国家药品监督管理局药品审评中心

摘要

人体药效学生物等效性试验是用于评价低分子量肝素仿制品与原研品活性成分一致性和治疗等效性的支持性证据，然而目前美国食品药品监督管理局( FDA) 和欧盟药品管理局( EMA) 对其试验的具体要求不完全一致。本文结合相关指导原则，阐述低分子量肝素注射液人体药效学生物等效性试验的一般考虑，对试验中若干关键问题进行探讨。

正 文

低分子肝素( LMWH) 是临床常用的抗凝抗栓药物之一，由未分级肝素( UFH) 为起始物料经过分级或降解而产生，用不同的解聚工艺产生的LMWH 通常具有不同的结构特性及药理活性，如不同的末端结构、不同的平均分子量及分子量分布、不同的抗FⅩa 和抗FⅡa活性及比例等。

低分子肝素注射液为不同的多糖链分子的混合物，现有分析技术无法对混合物中每一种多聚糖链进行分离，纯化，测序和含量测定，尤其是分子量大于3600 道尔顿的多聚糖链无法进行分析测定，因而低分子肝素的仿制药无法进行药代动力学终点的生物等效性试验。低分子肝素的抗Ⅹa 因子活性大于抗Ⅱa 因子活性。

基于人体内抗FⅩa 和抗FⅡa 的活性不同，不同LMWH 制剂具有不同的药效学特性，可能部分是由于抗FⅩa /抗FⅡa 活性比差异或低聚糖链分子量分布差异所致。

分子量越小，抗Ⅱa 因子效能越低，抗Ⅹa 因子/Ⅱa 因子活性效价比越大。

因而对于LMWH 的仿制药，人体药效学生物等效性研究通常用于确认仿制与原研制剂间的临床治疗等效性。

目前美国食品药品监督管理局( FDA) 和欧盟药品管理局( EMA) 关于LMWH 药物的药效学终点生物等效性试验均发布了相关指南，但相关要求不完全一致，同时，目前国内此类已申报品种的试验设计、实施及试验结果等方面还存在若干问题。

本文结合相关指导原则，阐述低分子量肝素注射液人体药效学生物等效性试验的一般考虑，对试验中若干关键问题进行探讨，旨在为此类产品的仿制和注册申报提供参考。

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监管机构对LMWH 人体药效学生物等效性试验的技术要求

1. 1 美国FDA 的技术要求

对于LMWH 类产品，FDA 制定了5 项标准来评价仿制品与原研品活性成分的一致性，其中第5 项标准即为人体药效学等效性试验。目前，FDA 发布了依诺肝素钠注射液和达肝素钠注射液两个具体LMWH品种的个药指南( 草案) ，即2011 年10 月发布的《Draft Guidance on Enoxaparin Sodium》［1］和2012 年9月发布的《Draft Guidance on Dalteparin Sodium》［2］。

依诺肝素钠个药指南( 草案) 中对人体药效学等效性试验提出了具体的要求，见表1

1. 2 EMA 的技术要求

EMA 分别在2013 年和2016 年发布了《关于含低分子肝素生物类似物的非临床及临床开发指南》草案和正式稿［3-4］，指南中对于人体药效学等效性试验提出相关要求。对于具体的LMWH 品种，EMA 的公开审评报告中也体现了相应的考虑［5］，见表2。

以上可见，对于等效性评价指标及标准，目前FDA 和EMA 的要求还不完全一致。

1. 3 药审中心的技术要求

为保证国内仿制的LMWH 类产品与进口原研产品的一致性，药审中心在2010-11 -15 发布了电子刊物《关于低分子量肝素类药品的审评思考》［6］，其中主要对药学研究的4 项技术标准进行了阐述; 2013 年11 月，发布电子刊物《关于仿制的低分子肝素类产品新增技术的意见》［7］，增加了第5 项评价标准即人体药效学等效性，具体的试验要求参照FDA 个药指南( 草案) 执行。

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LMWH 药效学生物等效性研究的总体考虑及试验设计若干问题

2. 1 总体考虑

低分子肝素的抗Ⅹa 因子活性大于抗Ⅱa 因子活性。基于人体内抗FⅩa 和抗FⅡa 的活性不同，不同LMWH 具有不同的药效学特性，可能部分是由于抗FⅩa /抗FⅡa活性比率差异或低聚糖链分子量分布差异所致。

分子量越小，抗Ⅱa 因子效能越低，抗Ⅹa 因子/Ⅱa 因子活性效价比越大。目前监管机构认可以抗FⅩa 和抗FⅡa 作为药效学终点指标的生物等效性研究。

对于LMWH，推荐开展一项在健康志愿者中的单剂量、皮下注射给药、随机、交叉给药试验研究，通过测定人血浆中抗FⅩa 和抗FⅡa 活性来评价仿制品与原研品的生物等效性。

受试者及试验用药物均应进行随机化，周期间应有足够长的清洗期( 一般为待测物7 倍半衰期以上) ，一般可不进行餐后给药的生物等效性试验研究。

通常应考虑药效学终点测量指标的变异性、剂量-响应曲线的陡度、受试者筛选、检测方法学的灵敏度及可靠性、试验的质量控制等因素。

对于等效性评价指标及标准，目前FDA 和EMA的要求还不完全一致，主要表现在两个方面: ①药效学等效评价指标要求。FDA 以抗FⅩa 因子作为主要的等效性依据，将抗FⅡa 因子作为次要的等效性依据，而EMA 将抗FⅩa 和抗FⅡa 均作为主要的等效性依据; ②等效性判断标准。FDA 要求抗FⅩa 的主要药效学参数Emax、AUEC 的90% CI 均需满足80. 00%～125. 00%，而EMA 要求抗FⅩa 和抗FⅡa的主要药效学参数Emax、AUEC0-t的95% CI 满足80. 00% ～ 125. 00%，对AUEC0-inf不要求。

同时，目前国内已申报此类品种的试验设计、实施及试验结果等方面还存在若干问题。为此，药审中心于2018 年6 月召开LMWH 类产品人体药效学等效性试验专家咨询会，经会议讨论认为，目前对于该类产品的人体药效学生物等效性试验，仍建议将抗FⅩa作为主要的药效学等效性评依据，受试制剂和参比制剂的其主要药效学参数Emax、AUEC0-t和AUEC0-∞的几何均值比值的90%CI 均需满足80. 00%～125. 00%的等效范围; 将抗FⅡa 仅作为支持性依据，主要是考虑到:

① LMWH 类产品主要通过与抗凝血酶Ⅲ( AT －Ⅲ) 结合，直接灭活FⅩa 因子而发挥抗凝作用; ②LMWH 类产品的抗FⅩa /抗FⅡa 的活性比大于1，对抗凝血酶的活性较小，在抗凝环节中起次要作用; ③对于多数LMWH 产品，因分子链相对较短，其抗FⅡa 活性半衰期短，活性检测受到的干扰因素较多。

同时需明确的是，对于分子链相对较长的LMWH产品，因抗FⅡa 的活性浓度相对较高，其等效性结果同样需要考虑进行评价。

2. 2 试验设计若干问题考虑

2. 2. 1 预试验

对于人体药效学终点生物等效性试验，剂量-响应曲线的陡度和药效学终点测量指标的变异性是影响结果的关键因素，而不同的LMWH 产品又通常具有不同的结构特性及药理活性，因此试验的设计及过程要求可能有所差异，如给药剂量、受试者例数、采血时间点设计、分析方法的可靠性、试验过程的管理和质控要求等。

预试验可能有助于帮助获取相关信息，以降低正式试验的风险。

2. 2. 2 剂量选择

对于药效学终点等效性试验，通常应选择在剂量-响应关系曲线中急剧上升区域所对应的剂量，以更灵敏地检测药物制剂间的差异，同时确定的给药剂量应在已批准不同适应证推荐的剂量范围内。

预试验有助于研究剂量－ 响应关系并确定在正式试验中所使用的给药剂量。

2. 2. 3 样本量确定

受试者的样本量应进行计算并有充分的统计学效力( 受剂量－ 响应曲线的斜率和药效学终点测量指标的变异性的影响) 。预试验的受试者例数无明确要求，可根据试验目的选择适宜的例数。

正式试验的受试者例数确定可综合考虑以下因素①检验水平: 即α值，其含义为Ⅰ类错误的概率，通常为双侧0. 1; ②检验效能: 即把握度，1－ β 值，其含义为Ⅱ类错误概率，通常为不小于80%; ③评价指标的个体变异，即CV%; ④制剂间评价指标的差异; ⑤等效界值; ⑥试验中受试者可能的脱落率。

2. 2. 4 受试者选择

受试者一般选择健康男性和非妊娠女性，试验方案中应有明确的受试者入选、排除及退出标准。

受试者入选筛查一般应包括但不限于以下方面: 一般情况( 既往病史、药物史、过敏史、烟酒史等) 、人口学、生命体征、体格检查、心电图、血尿常规、血生化、传染病筛查、肝肾功能、凝血功能、妊娠检查( 女性受试者) 、酒精呼气测试等。另需考虑到的是，LMWH 药效学等效性研究的采用抗FⅩa 和抗FⅡa 作为终点指标，目前其检测方法的灵敏度、定量下限等参数与人体内源性FⅩa 以及FⅡa 水平有较大关系，而受昼夜周期和生理性因素的影响不同人群中同一受试者的内源性FⅩa以及FⅡa 水平可能存在较大范围的波动，因此可能会对试验结果产生影响。

2. 2. 5 采血时间点设计、血样采集及处理

应根据药物和制剂特性确定样品采集的具体时间，以反映不同LMWH 品种的吸收、分布和消除相，采样时间不短于3 个末端消除半衰期，应能准确估计药物的Emax和消除速率常数( λz) ，末端消除相应至少采集3 ～ 4 个样品以确保准确估算末端消除相斜率。

实际给药和采样时间与计划时间可能会有偏差，应采用实际时间进行药效学参数计算。

内源性FⅩa 和Ⅱa 受昼夜周期和生理性因素的影响，不仅不同人群中同一受试者可能存在较大范围的波动，血样的采集及不同的处理过程条件也可能对抗FⅩa 和抗FⅡa 活性检测产生影响，如溶血、离心速度、抗凝剂种类及浓度等。

因此，临床采血过程中应尽量避免出现溶血，应建立不同溶血程度的鉴别和判断标准，记录实际采集血样的溶血情况和判断结果，并需在方法学验证过程中验证不同溶血水平对检测结果的影响。

采集后的全血样品应尽快进行离心处理，同时需考虑离心速度和时间对血浆中抗FⅩa和抗FⅡa 活性检测的影响。

2. 2. 6 药效学指标的测定

目前LMWH 类产品的检测方法主要有活化部分凝血酶原时间( aPTT) 检测和使用生色底物法检测抗FⅩa 和抗FⅡa 活性。aPTT 检测快速、方便，广泛应用于临床中心，但主要以检测受试者的内在凝血路径及共同凝血路径是否正常为目标，不是针对LMWH的药理作用途径( 即抗FⅩa 和抗FⅡa 的活性) 进行评估。

因此，目前检测分析实验室主要采用生色底物法来检测抗FⅩa 和抗FⅡa 的活性。无论是采取什么方法，均应能确保药效学终点指标抗FⅩa 和抗FⅡa 的活性浓度能被灵敏、准确的定量测定，进行未知样本检测之前需进行充分的方法学验证。

对于采用生色底物法来检测抗FⅩa 和抗FⅡa的活性，目前仍然面临一些方面的问题，如: ①抗FⅩa和抗FⅡa 为生物标记物，对于方法学验证和未知样本检测的接受标准尚未有统一的认识，目前主要参照配体结合分析( LBA) 的相关要求; ②采用不同商业试剂盒的检测结果存在一定差异; ③血样的采集及处理过程条件对抗FⅩa 和抗FⅡa 活性检测的影响因素较多，如溶血、离心速度、抗凝剂种类及浓度等; ④检测方法的灵敏度、定量下限等参数与空白血浆中内源性FⅩa 以及FⅡa 水平有较大关系; ⑤混合空白血浆以及单个不同来源的空白血浆存在内源性本底值差异，空白血浆中客观存在的本底信号对于抗FⅩa 活性尤其是抗FⅡa 活性的检测面临挑战，混合血浆和空白血浆中OD 值以及两者间差异与所采用的试剂盒、加入的抗凝血酶、过量的FⅩa 或FⅡa 以及生色底物量相关，因此不同实验室间可能存在偏差。

2. 2. 7 等效性评价指标及统计分析

根据LMWH 的药理学作用机制，将抗FⅩa 作为主要的等效性评价指标，抗FⅡa 作为次要的等效性评价指标。但考虑到不同LMWH 品种的特点，对抗FⅡa指标的等效结果可能同样需要考虑。

申报资料中应提供抗FⅩa 和抗FⅡa 的主要药效学参数，包括Emax、AUEC0-t、AUEC0-∞、Tmax等。

受试制剂和参比制剂的等效性评价主要基于抗FⅩa 的主要药效学参数Emax、AUEC0-t、AUEC0-∞几何均值比值的90% 置信区间满足80. 00% ～ 125. 00% 的等效范围，次要等效性评价指标抗FⅡa 的主要药效学参数及等效性评价结果作为支持性证据，其结果同样需在申报资料中提交。

关于给药前基线: 对于LMWH 类产品的药效学等效性试验建议检测给药前基线水平，目前明确的是，人体正常生理条件下FⅩa 和FⅡa 因子存在较低的基线水平且存在一定程度的波动，关于此方面仍然缺乏文献报道和充分的研究数据支持，且目前的检测方法学对于准确测定受试者的基线水平方面存在一定的难度，因此对于主要药效学参数计算是否进行基线校正尚未形成明确的定论。

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讨论

根据LMWH 类产品的特性和药理作用机制，一般推荐将抗FⅩa 作为主要的药效学等效性评依据，抗FⅡa 作为支持性依据。对于分子链相对较长的LMWH 产品，因抗FⅡa 的活性浓度相对较高，其等效性结果同样需要考虑。

对于人体药效学终点生物等效性试验，剂量－响应曲线的陡度和药效学终点测量指标的变异性是影响结果的关键因素，而不同的LMWH 产品又通常具有不同的结构特性及药理活性，因此试验的设计及过程要求可能有所差异，如给药剂量、受试者例数、采血时间点设计、分析方法的可靠性、试验过程的管理和质控要求等。

需考虑到的是，根据不同LMWH 制剂的特性和作用特点，其生物等效性研究的相关要求可能有所差异。另外，目前对于药效学终点指标抗FⅩa 和抗FⅡa 活性的检测方法学方面还面临一些挑战，为确保药效学终点指标定量测定结果的可靠性，建议在进行未知样本检测之前需进行充分、可靠的方法学验证。