老师们在选择做转录组测序的时候，很多人会纠结要不要做链特异性文库，链特异性文库和普通文库有什么不同？链特异性文库会给我的项目带来哪些有用的结果？今天小编就给大家细数下链特异性文库的那些事。
Q1
什么是链特异性转录组测序？
链特异性转录组测序(strand-specific RNA-seq)可以保留转录组测序时转录本的方向信息，即可以确定转录本是来源于基因组的正链或负链。
Q2
普通转录组和链特异性转录组的文库有何区别？
目前构建链特异性文库的方法有多种，其中用的最普遍的是dUTP方法，即在第二条链合成时用dUTP代替dTTP，PCR前采用UDG酶消化掉含U的DNA链，测序得到的转录本序列信息，只是来源于一条链。测序后的数据分析可确定转录本是来自正链还是负链。
Q3
链特异性文库有哪些优势？
01
定量更准确
链特异性测序方法可以区分reads是来源于正链还是负链，因此在计算某些转录本的表达量时可以排除来自其互补链上的转录本表达的干扰，使得基因定量更精准。
我们以IL24基因为例，Interleukin(IL)24是IL10家族的分泌蛋白，其表达已在某些细胞类型中被鉴定。在体内，IL24主要在炎症条件下由皮肤组织细胞表达。从图1中可以看出在链特异性文库中IL24基因几乎是没有表达的，但在非链特异性文库中是有表达的，哪个结果更可靠呢？
图1 IL24基因链特异性文库与非链特异性文库定量结果
研究已证实IL24位于“+”链上，因此真正源自IL24基因的序列reads是反向互补并映射到“-”链上。因此，在链特异性文库的RNA-seq中，仅计数映射到“-”链的reads。可以看出，在链特异性文库几乎所有的reads都被映射到“+”链(如图2)。因此，不计算这些reads数，也说明了为什么在图1链特异性文库的IL24基因没有表达。链特异性文库比非链特异性文库基因的表达水平更可靠。
图2 IL24基因定量结果可视化图
(蓝色是比对到正链，绿色是负链)
02
有利于发掘潜在顺式天然反义转录本
天然反义转录物(Natural antisense transcripts,NATs)通常指天然情况下生物体内生成的反RNAs，它们可以与其互补的RNAs通过碱基配对，形成正义-反义RNAs双链(dsRNAs)。根据来源，NATs可以为两类:顺式NATs(cis-NATs)和反式NATs(trans-NATs)。Cis-NATs来自基因组同一位点相反链上的转录，互补区在两个基因的重叠部分，重叠长且完全互补，通常以“一对一”的方式调节有义链的表达。Trans-NATs来自基因组不同位点的转录，重叠区域短且不完全重叠，可以调节多个有义链的表达。
链特异性文库可以提高反义链上非编码转录本的检出率，同时也便于确定哪些位于基因间的非编码转录本的方向。
图3 水稻中鉴定到的一对一cis-NATs
为了全面鉴定水稻cis-NATs，文章采用链特异性文库对模式植物水稻(Oryza sativa L.)中具有明确方向的cDNA进行深度测序，收集在正常和三种非生物胁迫条件下(盐，冷和干旱处理)生长的水稻幼苗构建链特异性文库，以评估转录方向清晰的转录本。检测结果表明，大约89.4-95.5%的reads序列与正确的转录方向一致，与链特异性文库数据相反，之前的普通转录组文库数据中，只有一半的reads序列读取与相同转录方向的基因一致，证实了链特异性文库数据的可靠性，链特异性文库有利于发掘大量潜在顺式天然反义转录本。
03
对可变剪切事件的检测更准确
因为链特异性文库可以排除反义转录的影响，使得可变剪接事件的识别存在假阳性而降低。如发掘新的circRNA，circRNA由反向剪切形成，链特异性的测序方式有助于提高circRNA检测的准确率。
04
无参转录组组装更真实
在进行无参转录本组装时，明确转录本的方向性很有必要，普通转录组组装出来的unigene既包括编码转录本，也包括一些非编码转录本(比如lncRNA)，但是如果不区分正反链，那么有互补配对关系的编码与非编码转录本会被组装成一条转录本，链特异性文库更有利于无参转录组组装。
05
有利于原核生物操纵子(operon)的分析
原核生物的基因为多顺反子结构，如果不区分反义转录本上的基因，其对应位置的基因表达量会计算不准确，操纵子及基因结构的预测也不准确。链特异性测序能够更准确地对操纵子进行分析与鉴定。
图4 Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi)操纵子分析
说了这么多关于链特异性文库的事，相信大家在选择文库类型的时候也不会再纠结，链特异性文库做起来，来看一看微分的转录组产品。
微分转录组产品优势
1、建库成功率高＞98%，测序质量好Q30＞85%
2、构建链特异性文库，减少比对错误，保证结果的准确性
3、分析全面：标准分析+定制化分析
4、一站式服务：上游测序+下游QPCR验证