论文ID
1
名称
Characterizing human lung tissue microbiota and its relationship to epidemiological and clinical features
2
译名
肺部微生物表征及其与流行病、临床特征的关系
3
发表期刊
Genome Biology
IF：13.214
发表时间：2016年
作者：Yu G, Gail M H, et al.
实验设计
取样位置
意大利伦巴第及下游地区的五个城市（米兰、蒙扎、布雷西亚、帕维亚、瓦雷泽等）以及它们周围的自治市。
样本选取
肺癌样本从13个医院收集而来，包含了下游地区约80%的病例。流行病学上的数据通过个人采访及调查问卷的方式完成，临床数据从诊所的医师和出院记录收集而来。
样本收集
肺部组织样本在外科手术切除20min内用液氮速冻。样本分类为癌组织、癌旁组织、距离癌组织较远的区域。本研究中选取了距离癌组织较远的区域来减少癌症区域的潜在影响，称为良性肺部组织（non-malignant lung tissue）。每个个体至少收集一个良性肺部组织，至少有一个样本被病理学家确认无癌症核心。所有与癌组织接触的工具和材料都提前灭菌。最终选取了233个良性肺部组织和56个癌症组织。质检排除部分样本后，剩余165个良性肺部组织和31个癌症组织。
测序策略
扩增16S的V3+V4区，Illumina MiSeq PE300测序。测序还包括2个样本（粪便和生殖道）作为阳性对照来测试测序run的performance，20个阴性样本来检测可能由于DNA提取、PCR试剂带来的污染，4个阴性对照来排除PCR扩增过程中的污染。
图1 技术路线
65个良性肺部组织样本至少产出了1000个reads/sample用于后续的分析。
实验对象大部分是男性（83%），平均年龄66.6岁；53%居住在米兰的城区；大部分是烟民（50%现在还抽、43%已戒烟），平均有43.5的烟龄；10-25%的人有支气管炎、肺气肿、肺炎；455的研究对象有慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary diseaseCOPD）。
大部分人都在肺叶的上部、下部有肺癌，3%的人肿瘤在主支气管上，92%的人经诊断在IA, IB, IIA, IIB,和IIIA期，8%的人处于肺癌晚期(IIIB, IV)。没有一例病人在手术之前接收放疗、化疗和其它治疗方法。病人在诊断为肺癌后，平均在201.9周后去世。
排除可能干扰的措施：测序还包括2个样本（粪便和生殖道）作为阳性对照来测试测序run的performance，20个阴性样本来检测可能由于DNA提取、PCR试剂带来的污染，4个阴性对照来排除PCR扩增过程中的污染。
HMP数据：研究者下载了Human Microbiome Project (HMP, phase 1;http://hmpdacc.org/)中V3-V5 16S rRNA gene序列作为对比。HMP数据包括138–1623样本，每个研究取样点至少有1000 sequence reads /sample (包括口腔,鼻腔，皮肤，粪便，阴道）
分析内容
1.肺部良性组织微生物的物种组成、功能特点
将以下微生物定义为核心微生物：在80%的样本中都存在该微生物，不论其相对丰度如何。
门层级上良性肺部组织核心微生物包括：变形菌门Proteobacteria,厚壁菌门Firmicutes, 拟杆菌Bacteroidetes,放线菌Actinobacteria(如图2a).
在属层级上核心微生物包括变形菌门Proteobacteriagenera：不动杆菌属Acinetobacter, 假单胞菌属Pseudomonas, 罗尔斯通菌属Ralstonia, 以及2个未知属的物种, 一个来自Comamonadacea另一个来自Oxalobacteraceae。与NIAID (National Institute of Allergy and Infectious Diseases)中A-C致病性属、PATRIC database中定义为致病菌物种进行比较，可能的致病菌属有葡萄球菌Staphylococcus,链球菌Streptococcus,与伯克霍尔德菌Burkholderia，均是低丰度的物种，约为2%。
利用PICRUSt基于16S基因预测的功能基因分析见图2c，功能基因的变化差异比物种差异变化要小。
图2 核心微生物
2.肺部良性组织微生物的物种组成、功能特点
将肺部组织微生物的组成与丰度与HMP上其它人体位点的微生物进行比较，通过phylum/KEGG module的相对丰度来计算Euclidean distances，最后得到主成分分析图。
肺部组织微生物形成了截然分明的聚类簇，与口腔微生物等健康人体的微生物距离较远，见图3a。
以功能基因来看，分类更为明显，见图3b，在口腔微生物与肺部微生物几乎没有overlap。
肺部与身体其他部位的微生物聚类热图显示如3c所示，肺部微生物确实与其它部位微生物不同，并且变形菌门Proteobacteria, Thermi, 蓝藻Cyanobacteria的相对丰度要更高。
Thermi在肺部组织的相对丰度为8.8%，但在其它身体部位较低，左肘窝的丰度最高，为0.05%。另外相似的情况出现在功能基因预测上，肺部微生物的KEGG modules中amino acid metabolism,xenobiotic biodegradation and metabolism,and lipid metabolism是相对丰度较高的。
图3 不同部位微生物种类及基因功能差异
3.样本中的菌群结构特征良性肺部组织与人口统计学、临床相关性研究
研究发现不同居住地区病人的肺部微生物多样性和变形菌门Proteobacteria相对丰度有显著的差异，如图4a所示。
来自更低的人口密度(1470个居民/km2) 瓦雷泽地区的样本，有更低的α多样性和更高丰度的变形菌门Proteobacteria，但来自更低的人口密度(7389个居民/km2) 瓦雷泽地区的样本，有更高的α多样性。在α多样性、Proteobacteria的丰度与PM10的相关性上，也会得到相似的结果，如4b所示，这些情况与患者之前的空气暴露有关。继续分析支气管炎史、癌症发展阶段时，采用回归调整也会得到相似的结果，见图4c，这些回归分析包括PM10和居住地点。采用MANOVA adjusted工具发现，当居住地点和PM10都包括时，出现了显著性的差异，但只有居住地时，无显著性差异。
良性肺部组织样本的微生物PD_whole_tree显著性增加了，但癌症的IIIB 、IV阶段Shannon’sIndex并未增加。癌症的IIIB 、IV阶段中栖热菌属Thermus的相对丰度显著性增加，见图4c。
至于功能基因的变化，与IA 到 IIIA阶段相比，IV阶段的病人中分泌系统、氨基酸代谢, 醛固酮调节，钠重吸收和amoebiasis pathways的丰度增加。
图4 不同地区样本α多样性分析
4.良性肺部组织与癌症肺组织微生物的差异
利用之前冻存的56个样本，将每个样本的reads数调整到＜1000后，与良性组织样本进行比较，可以看到癌症微生物中的α多样性比良性组织微生物中要大，见图5a。
此外，在组织学上，癌症微生物与良性组织微生物相比较，有显著的差异性，而在癌症组织学上，良性肺部组织微生物无较大的差别，但具有恶性腺瘤的样本有更高的PD_whole_tree，如5b所示，相对于鳞状细胞癌，恶性腺瘤类型中栖热菌属Thermus相对丰度增加，罗尔斯通菌属Ralstonia相对丰度减少。
图5 良性/肿瘤组织微生物α多样性差异
小结
大样本量的肺组织微生物研究，文章发现肺部微生物具有显著不同的特征，变形菌门Proteobacteria(60%)是优势物种，与口腔和其它身体部位的微生物截然不同。
另外深入研究了肺部组织微生物的组成、功能以及它们与人类生活方式和临床疾病的关系，发现空气污染和抽烟史能够影响肺部微生物，在慢性支气管疾病和肺癌晚期中微生物组成是不同的，栖热菌属Thermus肺癌晚期中是优势物种，军团杆菌Legionella在癌组织转移的患者中丰度更高。在此外需要更多不患肺癌的肺组织样本间的研究来确认本研究的结果。
看点
1
大样本量的肺癌组织微生物研究，并且保证在取样中所有样本的取样方式都相同。
2
研究结果与环境因素结合起来，如PM10、人口密度等，探讨可能的环境因素。
3
对可能的污染情况进行排查与验证，进一步证明实验结果的准确性。