阮婷婷，鞠武建，熊海伟，姜利芳，许悦，王广基

中国药科大学江苏省药物代谢动力学重点实验室

上海药明康德新药开发有限公司测试事业部药性评价部

摘要

药物代谢的稳定性测试是新药发现阶段的关键环节，实现药物的低清除率通常是药物代谢稳定性设计中的重要目标。

如何准确评估低清除率药物的代谢稳定性参数，并用体外代谢数据预测人体药动学已经成为新药研发阶段的挑战。

传统的肝微粒体模型和悬浮肝细胞模型的孵育时间短，低清除率药物无法产生足够的代谢转化，因此进一步模拟体内环境和延长肝细胞培养时间的新型模型逐渐发展起来。

本文重点介绍了新型的低清除率药物代谢稳定性预测模型的原理和优缺点等，包括肝细胞传递式培养模型、单层贴壁肝细胞培养模型、共培养模型和微灌流模型等，同时对模型的发展趋势进行展望，以期为早期先导化合物的代谢稳定性检测提供借鉴和优化。

正文

在药物早期发现和研发中，药物代谢和药代动力学( drug metabolism and pharmacokinetics，DMPK) 的重要目标是通过体外代谢数据等预测人体内药代动力学( pharmacokinetics，PK) 参数并确定给药方案。

药物代谢在创新药物的研发中具有重要地位，大约70% 的市售药物的清除过程是经过肝脏代谢清除完成的，清除率作为最重要的PK参数，在评估药物半衰期和生物利用度上起着关键的作用［1］。

而药物的体外内在清除率( in vitroCLint) 主要通过代谢产物生成法或原药消除法测定，其中原药消除法的应用更加广泛。近年来，由于药物体外吸收、分布、代谢、排泄( 即ADME) 性质的高通量筛查，以及毒性筛选和早期代谢物鉴定技术的有效使用，在药物研发阶段即可通过一种快速的结构-活性关系( structure-activity relationship，SAＲ) 设计提高药物的代谢稳定性。

药物代谢稳定性的增加可以减少药物剂量，增加药物体内暴露量，并延长药物半衰期，因此实现药物的低清除率通常是药物设计中的重要目标［2］。

低清除率药物( low-clearance drugs) ，即慢代谢药物( slowly metabolized drugs or low-turnoverdrugs) 是一类在传统的人肝微粒体( human livermicrosomes，HLMs) 和悬浮肝细胞代谢模型中无明显的母药转化的药物［2］，且其肝清除率( CLh) 一般低于30%肝血流量。

有调查结果显示，低清除率药物的数量在逐渐增加，大约有30% 的候选药物的CLint低于10 mL /( min·kg) ［3］。

传统的代谢模型在慢代谢药物的CLint测定上具有明显的局限性，并且代谢酶表型鉴定实验及代谢产物鉴定实验也会因化合物无法产生足够的代谢转化而受到影响，给药物代谢途径及机制研究带来困难。

近年来，新型的体外肝细胞模型逐渐发展起来，并应用于慢代谢药物CLint测定中，这些模型在体内体外相关性( in vivo-in vitro correlation， IVIVC)上显示出了优势，并逐渐替代传统的微粒体和悬浮细胞模型。

本文结合自己课题组的研究，主要对传统模型及已发表文献中的用于慢代谢药物代谢稳定性测定的新型肝细胞体外代谢模型的研究进展进行综述，比较了各类模型的原理与优缺点，旨在为药物的早期筛选工作提供参考和借鉴。

1

传统肝微粒体模型和悬浮肝细胞模型

用人肝微粒体和人肝细胞测定药物体外CLint从而预测人CLh是一种常用的计算方法［4－ 6］，其体内体外相关性研究的主要目标是能够应用肝微粒体和肝细胞体外代谢稳定性数据预测体内清除率数值，大数据集的分析应用使清除率预测的准确度有了很大的改善［5］，但对低清除率药物的代谢稳定性预测仍然很困难。

在传统的肝微粒体孵育实验中，测试化合物与辅因子等在维持药物代谢酶活性的条件下孵育［7］，由于微粒体中的酶活在孵育过程中会缓慢降低，因此孵育时间通常低于1 h，CLint检测定量下限为12 μL /( min·mg) ，运用比放系数换算后为: 10 mL /( min·kg) ［2］。

在悬浮肝细胞代谢稳定性测定中，由于细胞活率和酶活的降低，孵育时间一般低于4 h，CLint检测定量下限为2. 5 μL /( min·106 cells) ，运用比放系数换算后为:6. 3 mL /( min·kg) ［8－ 9］。

传统模型具有孵育时间短、代谢转化低、检测下限高的特点，低清除率化合物的CLint不能被准确预测，导致化合物的CLint被高估，同时半衰期将被低估，在临床阶段，半衰期被低估的这类药物会表现出极长的半衰期。

当药物设计的初期目标之一为需要在短时间内到达靶点，这时极长的半衰期与药物设计的初期目标不一致，且极长的半衰期也会带来药物的安全性问题。

传统模型一般会考虑增加酶量( 即更多的微粒体或更多的悬浮肝细胞) 或延长孵育时间提高药物的代谢转化，但Jones 等［10］对酶活性的研究表明，通过增加酶量以及延长孵育时间测量慢代谢药物的清除率，由于系统中酶活的损失明显，可能会产生非线性双相动力学，用原药消除法计算CLint和CLh时，需要尽量降低酶浓度及减少孵育时间。

因此，传统代谢模型在慢代谢药物的CLint测定上具有明显的局限性，随之而来，具有更长代谢酶活维持时间的新型体外肝细胞模型逐渐发展起来。

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2

新型肝细胞培养模型

肝细胞相比肝微粒体具有更多的氧化、还原、水解和二相结合反应需要的酶，在体外系统中，许多新型的模型倾向于基于肝细胞系统进行优化，并进一步模拟体内环境，延长肝细胞的酶活保持时间，孵育时间的延长为监测到慢代谢药物足够的代谢转化提供了可能。

2. 1 肝细胞传递式培养

Di 等［3］在2012 年提出悬浮肝细胞传递式培养系统( relay method) ，并选取了7 个体内CLint为2 ～ 15 mL /( min·kg) 的慢代谢药物进行模型验证。

此模型的原理是将4 h 孵育结束后的孵育液离心沉淀人肝细胞，随后取上清液转移至新的细胞板中并冷冻。第2 天解冻上清液并加入新鲜制备的悬浮肝细胞，继续孵育测试化合物。

重复5 次操作( 图1) ，累积孵育时间可达20 h，由于每4 小时使用的均是新鲜解冻的悬浮肝细胞，细胞在整个时间段内均具有代谢能力。

结果均准确预测，5个化合物的CLint( 在体内数据的2 倍范围内) ，而另外2个化合物噻吗洛尔( timolol) 和佐米曲坦( zolmitriptan)不能被准确预测的原因则可能分别为CYP2D6的多态性效应和缺乏肝外单胺氧化酶( monoamineoxidase，MAO) 的代谢有关。

Di 等［11］随后建立了其他种属如大鼠与狗的肝细胞传递培养方法用于低清除率药物的测定，除了一些转运体明显介导的药物或具有肝外清除的药物，其他药物的结果显示体内外相关性较好( 在体内数据的2 倍范围内) 。

Ballard 等［12］随后也将此方法运用在代谢产物鉴定中，并且结果显示，对于那些在代谢时需要发生氧化、偶联反应和连续反应的药物的代谢产物鉴定中表现出更好的性能，同时两轮的药物肝细胞传递已经产生了足够的代谢产物，进一步的传递孵育未显示优势，该方法目前也已经开发用于慢代谢药物的代谢酶表型鉴定实验中［13］。

Peng 等［14］ 建立了贴壁肝细胞传递式培养( plated hepatocyte relay assay，PHRA) ，选取了低清除率药物地西泮( diazepam) 及甲苯磺丁脲( tolbutamide)，以24 h 为一个孵育周期，通过不断将孵育液转入新的贴壁细胞，孵育至120 h 或更长，结果显示，药物呈线性良好的时间依赖性消除。

由于肝细胞传递式培养模型基于传统培养模型方式上的延伸，因此操作较为简单，方法也易懂。由于上清液板可以被冷冻直至下一次解冻，灵活性也更强。

同时，由于可以使用冰冻的混合捐赠者肝细胞( pooled-donors hepatocytes) 进行测定，有助于减少因不同捐赠者之间的酶活个体差异导致的变异性。

但此方法操作周期较长，消耗的细胞量多，成本较高，且由于新鲜细胞的不断补充，在计算过程上也增加了难度［14］。

2. 2 单层贴壁肝细胞培养模型

2. 2. 1 肝细胞单层培养模型

肝细胞单层( monolayerhepatocyte) 培养是将肝细胞培养在预铺胶原的板上，胶原是细胞外基质( extracellular matrix，ECM) 的重要组成成分，可增加细胞附着在培养板上的能力并提高细胞特异性形态学及功能，使药物代谢酶的活力与悬浮肝细胞相比能维持的时间更久［15］。

Griffin 等［16］最早比较了运用单层大鼠肝细胞培养体系与悬浮肝细胞培养体系预测低清除率和高清除率( high-clearance) 药物体内与体外CLint的相关性差异性，结果显示单层贴壁细胞模型对于低清除率药物甲苯磺丁脲的CLint预测更准确，而悬浮肝细胞模型对高清除率药物7-羟基香豆素( 7-ethoxycoumarin) 的CLint预测更准确。

可能的原因是: 在悬浮肝细胞的振荡体系下，药物被摄取进入肝细胞的速率更高，也有一部分原因是悬浮肝细胞缺乏外排转运体，增加了肝细胞内药物浓度。Blanchard 等［17］用同样的体系对比了低清除率药物波生坦( bosentan) 、中等清除率药物咪达唑仑( midazolam) 和高清除率药物纳洛酮( naloxone) 的肝清除率。

结果与Griffin 等［16］得出的类似，即单层贴壁肝细胞的孵育时间能使慢代谢药物有足够的代谢转化，对慢代谢药物的清除率测定相比悬浮肝细胞模型测定值更加接近体内值。

肝细胞单层培养模型孵育时间高于悬浮肝细胞，但是，Smith 等［18］提出，此模型中肝细胞酶活在24 h 后开始降低，因此孵育时间应低于24 h，因此对于那些代谢极慢的化合物来说，无法保证足够的孵育时间。

2. 2. 2 “三明治”培养模型“

三明治”培养( sandwich culture) 系统是在Monolayer 单层肝细胞培养的基础上逐渐发展起来的，此模型的原理是在肝细胞上再铺一层人工基质胶，肝细胞在培养板上形成“夹心”培养，此方法可重建细胞极性并形成完整的胆管网络，更加模拟肝细胞的体内环境［19－ 22］。

本课题组建立了冻存人肝细胞“三明治”培养法，通过肝细胞形态学观察、主要的CYP酶活和基因表达的测定，证明此模型培养天数可达7 d，并选取了安替比林( antipyrine) 、甲苯磺丁脲、丙吡胺( disopyramide) 等7 个不同清除率的化合物进行代谢清除和代谢产物鉴定的测定，结果显示除安替比林外，其他药物均有显著代谢转化，且对低清除率化合物的预测准确度大于高清除率化合物，同时随着培养天数的延长，有利于代谢产物的积累，而安替比林则可能由于极低的清除率而无法被测定。

文献中也不断报道了各种使“三明治”贴壁肝细胞的表型和功能维持更长时间的的优化体系，如改变细胞密度、培养基类型、细胞外基质成分，或补充新型添加物及新铺第二层胶［23－ 24］。Lancett 等［25］提出在孵育培养基添加新型补充物HepExtendTM 后可将CLint检测下限降低至0. 1 μL/( min·106 cells) ，83%被选取的低清除率化合物的代谢清除率可被准确预测( 在体内数据的3 倍范围以内) ，因此补充物的添加可显著改善低清除率药物的预测。Nicoline 等［26］在传统的大鼠肝细胞“三明治”培养法代谢模型中，引入一种数学模型，计算慢代谢药物甲苯磺丁脲的体外内在清除率。

培养基中母药消除数据被代入系统所依赖的数学模型参数中( 胶扩散系数，蛋白结合和肝细胞-基质胶培养基分配比) ，此方法成功预测了甲苯磺丁脲的内在清除率。但“三明治”培养模式下的肝细胞在一段时间后会脱分化，仍然无法满足一些半衰期更长、清除率极低的药物。

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2. 3 共培养模型

肝小叶是肝脏的基本单位，主要由肝实质细胞，临近的肝非实质细胞( non-parenchymal cells，NPC) ，如内皮细胞( EC) 、成纤维细胞、肝星状细胞和库普弗( Kupffer cells ) 细胞等组成［27］。

Oda等［28］提出肝细胞在体外培养时，由于缺少与邻近其他细胞及细胞外基质之间的联系，而只形成同型细胞间的相互作用［29］，会逐渐失去特异性的形态学和生物学功能。肝细胞与非实质细胞共培养后，可以显著增强肝细胞的表型和功能［30］，因此也有文献将共培养模型用于低清除率药物代谢稳定性参数测定方面的应用。

Khetani 等［31］最早提出了微图形的肝细胞共培养系统( micropatterned cocultures，MPCCs) ，即HepatoPac模型［31－ 33］。此新型的模型是将原代人肝细胞接种到胶原图案基质上来实现选择性细胞黏附，并使肝细胞被成纤维细胞如鼠3T3-J2 纤维细胞包围( 图2) 。

通过这种共培养设计，肝细胞能在6 周内保持良好的形态学及药物代谢Ⅰ相酶CYP450酶和Ⅱ相酶的基因表达［27， 34－ 35］，保留白蛋白生成和尿素合成等肝脏特异性功能［36］。

Wang 等［37］选取了27 种化合物并在不换液的条件下连续孵育了7 d，评估了MPCCs 体系的代谢产物生成能力。结果显示，此系统可以产生82% 已知的体内的排泄代谢产物和75% 的已知的体内循环代谢物，Ⅰ相和Ⅱ相的代谢产物及更多的次级代谢产物均能有一定的积累，表明此共培养体系对于药物的代谢产物的积累比悬浮肝细胞和其他体外系统强，同时在慢代谢药物的清除率测定上可能具有一定的潜力。

Chan 等［33］将此HepatoPac共培养体系用于测量低清除率药物的代谢参数，并评估了体内体外相关性。文中选取了17 种市售的体内低非肾清除率小于5 mL /( min·kg) 到中等非肾清除率5 ～ 15 mL /( min·kg) 的化合物，测定体外肝清除率，并与体内数据对比评估预测的准确性。

结果显示，在体内数据的2 倍范围内，低清除率药物的预测准确度可达到60%，而在体内数据的3 倍范围内有90%的化合物可被准确预测。同时文献将共培养体系测出的阿普唑仑( alprazolam) 、美洛昔康( meloxicam) 和甲苯磺丁脲的代谢数值与悬浮肝细胞的数值进行比较，结果显示，HepatoPac 的代谢转化是悬浮细胞的两倍以上。

Ramsden 等［38－ 39］利用HepatoPac 模型研究了慢代谢药物法得韦勒( faldaprevir) 的葡萄糖醛酸结合反应，证明了此模型相比悬浮肝细胞对葡萄糖醛酸结合反应的体内预测效果更好。上述研究结果均表明HepatoPac在预测低清除化合物的代谢稳定性参数及代谢途径等具有明显优势。

HepatoPac 模型是良好的预测慢代谢药物的代谢清除率、代谢途径和药物转运等的体外模型，但此模型的缺点是成本比较高，且实验过程相对复杂，需要的人力也较大，不适用高通量研究，并且对于此模型的培养条件( 如细胞密度等) 的确定还未有一个定论［40］。

2. 4 微灌流模型

2. 4. 1 HμＲEL系统

由于动态流动系统更加模拟体内流动循环系统，近年来静态模型也有向动态模型转化的趋势，HμREL是一类肝细胞与肝非实质细胞共培养的微灌流系统( microfluidicsystem) ［41］，此系统主要由HμREL生物芯片，流动的液体槽及蠕动泵组成，这些组件中的液体可通过管道互相连接，模拟生理药动学模型，与静态的系统相比，能得到更多的代谢产物。

Novik 等［42］证明这类模型能够区分出高清除率药物丁螺环酮( buspirone) 、中等清除率药物西地那非(sidenafil)和低清除率药物吲哚美辛( indomethacin) 的内在清除速率。

Hultman 等［43］进一步用此模型测定了14 个低清除率药物的代谢清除率并进行代谢产物鉴定，结果显示，70% 的药物可被准确预测( 体内数据的3 倍以内) ，CLint的最低检测限灵敏度是悬浮细胞的8 倍，并且与动态悬浮细胞模型相比，此模型能得到更多的代谢产物，证明此模型可被应用在慢代谢药物的内在清除率的评估上。

2. 4. 2 LiverChip

生物反应器LiverChip是一种微流体灌注3D 肝细胞培养技术，并开始逐渐运用在慢代谢药物清除率的测定上［44］。

此灌流模型是由多个生物反应小室，每个孔道包含完整的小泵使孵育培养液能够在整个系统中循环，预铺胶原的支架可使肝细胞成3D 状排列，这种循环流动的液体可以模拟体内肝细胞的环境( 图3) 。

当系统给药后，一系列样品被收取并分析其中的药物浓度。Vivares 等［45］测定了LiverChipTM中药物代谢酶活性并与经典的静态2D 模型进行对比，结果显示，各种主要的酶的基因可维持长达7 d 左右。

同时实验中还测定了低清除率药物甲苯磺丁脲的CLint，结果显示低清除率药物甲苯磺丁脲的CLint的清除率计算结果为2 mL /( min·kg) ，CLint检测下限明显低于传统模型。

Di 等［2］用LiverChipTM 模型测定了低清除率药物茶碱( theophylline) 、甲苯磺丁脲、丙吡胺和一些中等及高清除率药物在孵育72 h 后的CLint，结果显示，LiverChipTM 对低清除率药物CLint( 通过AUC 法计算) 预测更准确，而对高清除率药物咪达唑仑、双氯芬酸( diclofenac) 、维拉帕米( verapamil) 的预测低估更严重，这表明此系统对于低清除药物的CLint预测更具有潜力。

LiverChipTM模型与传统模型相比更能维持肝细胞功能，但此系统目前对低清除率药物做的相关验证较少，并且LiverChipTM模型中肝细胞与非实质细胞共培养技术还未应用，这也将是未来研究的一个方向［45］。

2. 5 肝癌细胞系HepaRG

由于人原代肝细胞价格昂贵、来源很少、生存时间短且批间差异较大，而人肝癌细胞系来源方便、生存时间长、实验的可重复性高，因此人肝癌细胞系在各领域应用研究并期望替代原代肝细胞的使用一直是一个热点方向［46］。

在各类肝癌细胞系中，HepaRG 细胞含有高活性的药物代谢P450 酶活性和转运蛋白，同时还有核受体的表达，已有文献表明HepaRG 在药物代谢P450 酶的诱导和药物清除率实验上具有良好的预测性［47－ 48］，因此相比其他肝癌细胞系，HepaRG 细胞在预测慢代谢药物的清除率上是最具潜力的。

Bonn 等［15］用HepaＲG 肝癌细胞系测定了12个药物的清除率( 低清除率药物为7 个) ，结果显示，s-华法林( s-warfarin) 和双异丙吡胺两个药物的CLint均能被有效检测到，CLint计算值可检测到低于0. 2 μL /( min·106 cells) ，CLint检测下限明显低于传统的肝微粒与悬浮肝细胞模型。

但文献对比了此模型与monolayer 贴壁肝细胞和HμREL肝细胞共培养模型预测CLint的准确性，结果显示贴壁肝细胞和HμＲEL两个体系中，大于70% 的所选取化合物能被准确预测( 体内预测值的3 倍以内) ，平均预测误差( average fold errors，AFE) 为1. 6 和2. 3，而HepaＲG 仅有50%的化合物能被准确预测，AFE 为2. 9，这表明HepaＲG 预测的准确度并没有贴壁肝细胞和HμREL两种模型好。

且在文献中选取的几个中等至高清除率的药物中，主要通过CYP2C9 和CYP2D6 代谢的丙咪嗪( imipramine) 的CLint无法被有效测定，可能与HepaRG 中CYP2E1和CYP2D6 两种药物代谢酶的活性偏低有关。

总体来说，新型的体外肝细胞代谢模型的发展为代谢慢的化合物的CLint测定提供了可能，与传统模型相比显示出了很多的优越性，但同时各类新型肝细胞模型也存在相应的局限性并需要更多的验证与改进。各模型的优缺点汇总在表1 中，以便于比较。

3

清除率数据分析方法

一般通过原药消除法和代谢产物生成法测定药物的CLint，但早期研发筛选阶段，代谢产物的代谢途径还不清晰，特别对于低清除率药物而言，由于代谢过程慢标准品很难获得，所以底物消除法应用最广泛，因而重点阐述此方法。

3. 1 体外t1 /2半衰期法

体外t1 /2半衰期法测定药物的CLint是文献中使用最多的基于原药消除法下的计算方式，它主要是通过线性消除得到相应的斜率kdep，同时通过

计算得到药物的半衰期，并代入随后清除率相关计算。

计算过程如下:

文献中为了评估各类肝细胞模型对清除率预测的准确度，即体内体外相关性研究，会将以下两数据进行比较。

第一类相关性比较方法: 将公式( 2) 中CLint，scaled与公式( 4) in vivo CLint进行比较进行内体外相关性研究，其中CLint，scaled是由体外肝细胞数据通过比放系数( scaling factors) 的代入计算得到的。

in vivo CLint通过well-stirred 模型公式换算得到。第二类相关性比较方法: 将公式( 3) 中CLh与文献中报道的总清除率CLtotal进行体内体外相关性研究。

fuB为全血中游离药物的占比( fuB =fup /RB) ，Qh 为肝血流量，通常代入20. 7 mL /( min·kg) ［49］。

3. 2 AUC 法

AUC 法是通过测定肝细胞孵育培养基中药物的经时浓度，计算浓度-时间曲线下面积，代入相应公式计算得到药物的内在清除率CLint，是原药消除法下的另一种计算公式［41］。

计算过程如下:

公式( 5) 中，C0和Ct是药物在相应时间点的浓度( μmol /L) ，AUC0 － t为0 到t 分钟的时间曲线下面积，V 为孵育体积( μL) ，N 为肝细胞数目。

AUC 法常被应用在不遵循简单的单指数特征消除的药物CLint测定系统中［2］。

3. 3 代谢产物生成法

在体外系统的底物消除法实验中，底物需要至少转化10% ～ 15% 才可认为测量是可靠的，用代谢产物生成法可检测到微量的代谢产物生成，更能满足分析的准确度和精密度并计算清除率［40］。

因此，测量代谢物的形成是测定低清除率药物肝内在清除率的一种可靠的方法。对于符合米-曼方程的CLint的值计算可由Vmax和Km的比值获得，不同反应得出的Km和Vmax代入计算求出的CLint相加后，即可求出总的CLint。

但代谢产物生成法的局限性是代谢产物的标准品难以获得，无法完成定量实验，除非当产物为此药物合成时的前体药物( 如当酯类药物的代谢产物为羧酸时) ，这样产物标准品的获得则会容易很多，因此在先导化合物筛选阶段，此方法应用极少。

4

结语与展望

美国食品药品监督管理局( FDA) ［50］和欧盟药品管理局( EMA) ［51］法规中建议，体外代谢模型需要能准确预测体内清除率，并且能形成与体内类似的主要代谢产物并阐明代谢产物清除路径。

传统的药物代谢模型包括人肝微粒体及悬浮肝细胞模型，在测定低清除率药物的代谢稳定性参数上体现出明显的局限性［52］。

许多新型的体外代谢模型和技术逐渐发展起来，如肝细胞传递法、“三明治”培养法、共培养和流动模型等，这些新型的模型在慢代谢药物清除率的预测及代谢产物鉴定上也体现出了酶活保持时间长、体内体外相关性好和更多的产物积累等明显优势。

新型的体外代谢模型逐渐替代传统的微粒体和悬浮细胞模型，为先导化合物的早期筛选工作提供体外代谢环境的支持，极大减少了药代动力学参数获得过程中实验动物的使用及昂贵的临床实验的开展，但新型模型也具有通量低、价格昂贵等缺点。

并且许多文献中选取的大部分是CYP450 酶的底物，其他的non-P450 代谢酶如葡萄糖醛酸转移酶( UGT) 等的底物也在增加，对于这类低清除率化合物的验证工作研究较少［52－ 54］。

另外对于慢代谢药物的代谢酶表型鉴定也仍然是一大困难，因为在长时间的孵育过程中，CYP450 酶的阳性抑制剂必须在这段时间内能维持一定的浓度。

未来对新型模型的逐渐优化从而实现高通量且更加准确的分析对于慢代谢药物内在清除率、代谢产物鉴定和代谢酶表型鉴定具有重要意义。