2019.05.27 周一

Cell reports: 丁酸盐通过HIF-1依赖机制保护艰难梭菌诱导小鼠结肠炎症

编译|钟浩

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2019年4月16日，Cell Reports (IF:8) 在线发表了巴西坎皮纳斯大学Marco Aurélio Ramirez Vinolo等人的一篇题为《丁酸盐通过HIF-1依赖机制保护小鼠免受艰难梭菌诱导的结肠炎》的文章。

文献内容

研究背景

艰难梭菌是一种革兰氏阳性厌氧杆菌，它能形成孢子，是肠感染的常见原因，主要影响住院病人，被认为是一个严重的公共卫生问题。近几十年来，感染艰难梭菌（CDI）患者的发病率、发病率和死亡率持续上升。临床疾病的发展通常发生在敏感宿主摄取孢子后。感染艰难梭菌的一个主要风险因子是抗生素的使用，这会导致宿主肠道菌群的变化，并削弱耐药性。CDI呈现的症状与艰难梭菌的两个主要毒力因子作用有关，即毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）。这些毒素糖基化Rho家族蛋白，使它们处于非活性状态，从而影响下游途径，包括细胞骨架组织。细胞骨架效应导致细胞肌动蛋白结构的破坏和肠上皮细胞（IECS）的死亡，从而导致屏障功能的丧失，从而诱发更严重的炎症反应。

肠道菌群对CDI有抵抗作用。在人体和小鼠试验的研究表明，肠道菌群可防止艰难梭菌在肠道的定植，粪便菌群移植是治疗复发性CDI的有效疗法。已发现小鼠肠道菌群中特定成分的转移对CDI有抗性作用，如次级胆盐代谢物。然而，涉及肠道菌群的保护机制还不是很清楚。

肠道菌群和宿主细胞主要通过细菌代谢产生短链脂肪酸（SCFAs）联系起来的。这些分子（主要是乙酸、丙酸和丁酸）通过纤维代谢释放到肠腔并被IECS吸收。短链脂肪酸具有多种免疫调节作用。增加其肠道浓度的策略在减少组织损伤和增强免疫系统效应机制方面是有效的。通过这种方式，短链脂肪酸可以改善宿主对炎症和感染刺激的反应。最近的研究指出，CDI患者肠道中产短链脂肪酸的细菌已经消耗殆尽而且短链脂肪酸浓度显著降低。此外，与CDI抗性小鼠相比，CDI敏感小鼠的SCFA肠道浓度较低。该研究旨在探讨SCFA丁酸对急性CDI小鼠模型的影响。

研究思路

（1）首先探讨了艰难梭菌易感小鼠模型建立的可靠性，利用抗生素水喂养小鼠4天后，再腹腔注射克林霉素，一天后灌胃艰难梭菌。

（2）探究口服丁酸、三丁酸甘油酯和菊粉对CDI的保护作用。

（3）探究丁酸是否是通过干扰艰难梭菌的定植或毒素的产生。

（4）考察丁酸对肠道炎症的影响及肠道炎症对CDI的影响。

（5）丁酸对肠道屏障和微生物移位是否产生影响？

（6）研究丁酸对肠上皮细胞（IECs）的作用，丁酸是否促进了IECs对艰难梭菌毒素的抵抗作用。若有，通过基因表达确认丁酸是否是通过激活IECs的HIF-1来发挥作用的。

（7）为了进一步证实丁酸通过激活HIF-1发挥作用的，通过基因敲除鼠实验验证，并通过转录组学探究其潜在的作用机制。

研究结论

（1） 尽管抗生素治疗后肠道菌群部分恢复，但丁酸的产生仍然受到持续的损害。

（2）丁酸治疗组小鼠的临床和结肠组织学评分明显改善，丁酸处理的小鼠在感染高峰时表现出更好的参数，特别是上皮溃疡和粘膜下层区域的细胞堆积。丁酸、三丁酸甘油酯或富含菊糖的饮食给药对CDI的影响相同，这都能保护小鼠。这两种策略都增加了抗生素处理小鼠的肠道丁酸的浓度。富含菊粉的饮食还增加了醋酸和丙酸的浓度，这可能与饮食效果有关。

（3）丁酸处理影响感染前的微生物菌群结构，但不影响特定门/属或细菌丰富度。丁酸对感染艰难梭菌的无菌小鼠仍有保护作用，表明丁酸的部分作用与菌群的变化无关。作者发现这种有限的艰难梭菌只在高浓度(50 MM)时生长，10和50 mM丁酸由于细胞毒性和产孢作用而增加了TcdA和TcdB的产生。而丁酸处理不影响艰难梭菌在无菌或无菌小鼠体内的定植或产毒，表明丁酸的有益作用并不直接影响艰难梭菌的负荷或毒素的产生。

（4）丁酸在感染高峰时降低了结肠中促炎细胞因子的水平，并增加了抗炎细胞因子IL-10的水平。丁酸对抗生素处理小鼠细胞因子的产生无影响。与单纯使用抗生素的小鼠相比，使用抗生素和补充丁酸的小鼠mLNs中CD103+树突状细胞的数量增加。为了深入了解T细胞和抗炎细胞因子IL-10的作用，作者在Rag1和IL-10缺陷小鼠上重复实验。在这两种菌株中，丁酸对CDI都有保护作用，表明在这个模型中丁酸的部分作用与对T细胞或IL-10的作用无关。

（5）丁酸治疗感染的小鼠增加了与细胞旁连接蛋白相关的基因的表达，包括Claudin-1和Occludin。与只接受抗生素治疗的小鼠相比，丁酸处理的小鼠的这种蛋白增加。这些结果表明丁酸直接作用于肠屏障，这可能与在CDI模型中观察到的保护作用有关。

（6）结肠细胞暴露于艰难梭菌培养上清液后，跨上皮电阻(TEER)降低，丁酸部分阻止了这一作用。丁酸也减弱了艰难梭菌上清液对存活率和单层还原的影响。最近的研究表明，丁酸稳定了IECS中的缺氧诱导因子1a(HIF-1a)，这一作用与肠屏障完整性相关。与对照组相比，丁酸培养的细胞中HIF-1靶基因和与副细胞连接相关的基因表达量较高。这与HIF-1稳定在其中起作用的观点一致，作者发现与HIF稳定剂Bay 85-3934共培养的HCT116细胞对艰难梭菌上清液诱导的死亡更具抵抗力。丁酸对感染小鼠HIF-1a mRNA及其靶基因表达的影响。

（7）    与对照组相比，丁酸盐处理的缺陷小鼠在细菌移位方面没有任何变化，这一发现证实了在HIF-1缺陷小鼠中丁酸对肠道通透性的影响消失了。

（8）    丁酸激活HIF-1可减轻CDI引起的肠上皮细胞损伤，增强机体对共生的免疫应答，减少肠上皮细胞向其他组织的移位。