背 景

人类繁殖始于中期II卵母细胞与精子细胞融合形成受精卵。在人类卵母细胞中，减数分裂的细胞周期从新生儿卵巢开始，在减数分裂I期停止，直到青春期，促黄体激素的激增将刺激减数分裂的进行并恢复排卵。这促使卵母细胞从中期I(MI)发育到中期II (MII)。I期前期停滞的卵母细胞中有一个完整的细胞核，称为胚泡(GV)，而卵母细胞恢复减数分裂的特征就是GV的分裂。GV分裂，MI期不对称分裂排出极体，获得MII期成熟的卵母细胞。在大多数哺乳动物中，这是卵母细胞能够成功受精的唯一阶段。

体外受精(IVF)现在占每年新生儿总数的1-3%。在卵巢刺激和人绒毛膜促性腺激素的作用下，一些患者的卵母细胞常处于不成熟状态，而完全的卵母细胞发育受阻只在少数女性中被报道，目前还没有发现与人类卵母细胞成熟停滞相关的基因。我们在一个有多个不育的女性成员的多代家系，以及六个不相关的家系中，发现具有相似的卵母细胞成熟停滞表型。

方法流程

结果分析

1

不同家系中TUBB8的突变

1)对家系1的患者进行了全外显子组测序后，发现了TUBB8编码区上c.T686C (p.V229A)错义突变。该基因在家系1中为父系起源的常染色体显性遗传模式。

2)另外6个不相关的家系中，不孕患者中发现了其他类型的TUBB8突变，这些突变分别是家系2(c.G1249A, p.D417N)，家系5(c.T88C, p.M363T)，家系6(c.G5A, p.R2K)和家系7 (c.G900A p.M300I)，且都是遗传自患者的父亲。此外，在家系3和4的患者中，检测到新生突变(分别为c.G785A，p.R262Q；c.C527T，p.S176L)(图1)。

图一 不同家系中TUBB8基因突变

2

体内微管的破裂

使用FLAG标记的载体转染到培养的(HeLa)细胞中，来研究TUBB8突变对体内微管行为的影响。在野生型TUBB8的情况下，除了高水平的转基因表达外，发现了协同组装成的正常微管网络(图2A，top panels)。相反，在TUBB8突变体中，在中等或高水平的表达量下，TUBB8蛋白融入的微管具有异常外观(图2A，center panels)，并且在许多情况下的导致微管网络完全消失(“消除”)(图2A，lower panels)。消除表型与预测干扰二聚体稳定性，β-微管蛋白折叠或聚合的突变强相关(V229A，S176L，M363T，R2K，M300I)，而预测干扰驱动蛋白结合的突变(R262Q和D417N)，导致微管组织发生改变的同时也保持其协同组装能力(图2B)。

图二 野生型和TUBB8突变体的微管表型结果

3

TUBB8的突变损害纺锤体组装

在小鼠卵细胞中显微注射任一TUBB8突变的RNA，会导致成熟停滞和畸形纺锤体，第一次的极体挤出率(6％-33％)显着低于野生型对照组(61±2.2％)(图3A)

S176L和D417N RNA导致小鼠卵母细胞的纺锤体组装严重或完全受损(图3B)

将TUBB8 S176L和D417N突变RNA现微注射到人类GV卵母细胞中。与小鼠卵母细胞的表型一致，纺锤体组装严重或完全受损(图3C)。

图三TUBB8突变体RNA影响小鼠和人卵母细胞中的纺锤体组装

结 论

1、TUBB8突变呈现遗传自父亲的常染色体显性遗传模式和新生突变，具有显性负相关效应。

2、TUBB8只分布于卵细胞和早期胚胎，在体细胞和精子细胞中不表达，该基因表达β-微管蛋白。

3、TUBB8突变影响α/β微管蛋白异质二聚体组装和分子伴侣的折叠，在体外实验中改变微管动力学，影响纺锤体的形成以及小鼠细胞和人卵细胞成熟。

文章亮点

1、研究选取意义重大的人类生存繁衍的方向开展；

2、获得罕见的四代卵子发育受阻的家系，使用有效的候选基因筛选方法找到相关突变；

3、采用详细的细胞功能验证不同家系中TUBB8突变。

2017年3月，微分基因入驻国家大基因中心，成为国家大基因中心“基因检测平台”运营企业，并成立安徽微分基因科技有限公司。8月，位于安徽巢湖的标准洁净实验室及医学检验所启动运营，占地约2100平方米。10月，全贯穿的基因检测平台、大数据处理平台、高通量自动化样本处理平台、一流的生物样本库开始正式运作。