随着全球经济的发展，进口贸易的增多，食品安全检测也日趋严格。常用于食品安全检测的聚合酶链式反应( PCR)技术，是目前大部分检测机构及医学实验室都在使用的常规技术。

然而该技术需要昂贵且精密的控温设备，耗费较长时间，在现场检测中不具备优势，因此， 我们需要更加简便的技术来提高检测效率。 

等温核酸扩增技术的问世为快速检测带来新的曙光。目前开发出来的等温扩增技术包括环介导等 温扩增技术(LAMP)、自主序列复制与依赖核酸序列性扩增技术(NASBA)、单引物等温扩增（SPIA）、链置换扩增技术(SDA)、信号介导的核糖核酸 扩增技术(SMART)、依赖解旋酶的等温扩增技术（HAD）、滚环扩增技术(RCA)、快速等温检测放大 技术(RIDA) 、切刻内切酶核酸恒温扩增（NEMA）和重组酶聚合酶扩增技术 (RPA)等。

文章对重组酶聚合酶等温核酸扩增技术及其在食品安全检测方面的应用进行综述。RPA 技术全称重组酶聚合酶等温核酸扩增技术，是聚合酶链式反应(PCR)的一种替代品，可快 速、便携地进行核酸检测分析。

RPA 与 PCR 扩增一样具有特异性，但速度快得多，结果通常在 3～ 10 min 生成。与 PCR 不同的是，RPA 反应不需要热变性，因此不需要昂贵的热循环设备。RPA 对操 作温度要求并不严格，反应在 37～42℃的温度下工作最优，比其他等温扩增技术需要的温度要低， 能在广泛的环境温度下工作。

RPA 可以在多种应用中取代 PCR，如传染病诊断和食品安全检测，它 非常适合于现场、护理点和其他设备缺乏的环境，特别是对于检测速度需求较高的情况下。

一、RPA 技术介绍 

1、反应原理 

RPA 技术的整个反应体系包含噬菌体重组酶 UvsX 及其辅助因子 UvsY、寡苷酸引物、单链核 酸结合蛋白(SSB)、DNA 聚合酶，DNA 模板、ddH 2 O 和 Mg2+等。

其扩增原理是恒温条件下，重组酶与长约 30～35 nt 的寡核苷酸引物结合形成复合物，并在双链 DNA 模板中寻找靶位点，重组 酶打开双链 DNA，引物与同源序列发生链交换反应形成 D 状环，SSB 随即结合被置换的 DNA 链，防止引物解离，重组酶解离后引物 3'端暴露并被链置换 DNA 聚合酶识别，在 DNA 聚合酶的作 用下 DNA 扩增反应启动；引物与双链 DNA 配对形成复制所需的自 3’羟基末端，并在聚合酶的作用 下进行复制延伸，继续 DNA 合成过程并完成两个引物的扩增，最后形成完整的扩增子。

2、引物设计 

RPA 引物设计原则：

(1)引物长度最长是 45 bp，最好为 30～35bp，过短会影响重组酶活性。

(2)5’端为 3 到 5 个核苷酸，且避免出现连续的聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，能促进扩增片段的重 组。

(3)3’端最好为胞嘧啶和鸟嘌呤，有助于聚合酶的稳定结合提升引物扩增性能。

(4)引物中避免出现特殊序列，如避免出现回文序列和连续的重复结构。

(5)引物设计时尽量避免容易形成发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。

(6)GC 含量过高(>70%)或过低(<30%)都不利于 RPA 扩增。

3、技术特点

RPA 技术与传统的 PCR 扩增相比在便捷性以及高效性上有显著的优势，与 PCR 技术相比有以下特点：

（1）反应能够在恒温条件下进行。尽管 RPA 的反应模式与 PCR 相似，但不同的是 PCR 反应需要 加热使 DNA 模板变性，而 RPA 不需要，在 37～42℃的条件下，利用重组酶引物复合体扫描双链 DNA，促使 DNA 链上同源位点的互换。

（2）耗时短。RPA 反应速度快，能在 5～10 min 完成检测。在许多情况下，没有经过专门训练的 人就可以采集样本，进行实验，并在半小时内得到结果。检测速度远胜于其他等温扩增技术。

（3）操作简单。RPA 扩增的基础体系含有 DNA 扩增所需的所有试剂，只需加入引物和模板就可以反应，不需要复杂的样品前处理，这大大提高了操作效率，避免繁琐的实验步骤带来可能性的误差。

（4）不受场地的限制。PCR 扩增需要专门的 PCR 仪，RPA 技术由于对温度要求低，甚至可以用 人体温度进行，并可以在条件较为简陋的地方进行检测。

（5）高灵敏性。在复杂样品中，RPA 技术可以检测单拷贝的 DNA 和几十个或更少拷贝数的 RNA 分子，而不需要事先进行核酸纯化和富集。

4、操作过程 

含有重组酶及聚合酶干粉的反应管中分别加入反应缓冲液、上下游引物以及模板 DNA，用蒸馏 水补至总体积，充分混匀，加入醋酸镁溶液，上下颠倒 8～10 次混合均匀，瞬时离心后，放置于所需 温度的水浴锅中反应 10～15 min。

二、RPA 及衍生技术 

1、直接重组酶聚合酶扩增技术(Direct-RPA) 

Direct-RPA 是一种快速、灵敏的检测方法。该技术不需要复杂的样品前处理环节，常温下就能够 对样品中的目标基因进行扩增，简化了过程分析，在 15～40 min 的反应时长内能完成实验要求，远低于 NASBA、HDA 等技术的时长要求。它既不需要 PCR 所依赖的热循环仪器,也不像环介导等温扩 增技术(LAMP)需要提前准备预变性的模板。

Direct-RPA 具有快速、灵敏、简单等优点，是 RPA 系 列技术的基础，但也有较明显的缺点，如产物的检测需要进行凝胶电泳，与其他等温扩增技术相比， 检测步骤比较麻烦。

2、 重组酶聚合酶扩增侧流免疫技术(RPA-LFD) 

侧向流动免疫试纸条（lateral flow device）是目前用于定性和半定量检测的简单装置。RPA-LFD 是指在 RPA 技术结合 LFD 的一种联用技术，两者相结合可建立一种快速灵敏的现场检测系统。

RPA-LFD 基于 RPA 扩增原理，用带生物素标记的引物和 FAM（6—羧基荧光激素）标记的探针与靶 核酸进行扩增反应 ，最终形成的扩增子既带有 FAM 基团又被生物素标记。LFD 前端带有 FAM 抗 体的纳米金粒，检测线上带有生物素抗体，将产物滴到试纸条上，扩增子上的 FAM 基团与 FAM 抗 体反应，检测线处的生物素抗体与扩增子上的生物素结合。最终，检测线上显示深紫色条带，未被捕 获的产物与质控线线处的特异性抗体结合显示深紫色条带。RPA-LFD 检测能在 15～20 min 完成， 25～45 ℃的环境中便可进行，因此，可用一些简单的加热装备，比如电热水器等便可实现精确检 测 。

RPA-LFD 检测结果能在横向流动试纸条上显示，裸眼便可观察，即使是非专业人员也可以直接 分析结果，非常适用于现场快速检测，尤其在经济条件差资源缺乏的区域，具有更好的应用前景。

3、重组酶聚合酶扩增酶联免疫吸附技术(RPA-ELISA) 

酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay)是抗原抗体的特异性反应，指将可溶性的抗 原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。

RPA-ELISA 技术是在 RPA 技术的基础上结合 ELISA 技术发展起来的用于检测核酸扩增产物的新型分析检测手段，综合了 RPA、ELISA 2 种技术的特点，在特异性、灵敏性等方面表现出优异的特点、而且操作过程简单，结 果不需要电泳检测和 RPA 产物纯化，较短时间内可以完成整个检测过程。

同时，能在数小时内对 大量待检样品进行筛选和鉴定，适用于资源匮乏的现场快速检测是一种有效的联用检测技术。但 RPA-ELISA 也存在缺陷，如重复性差，容易出现假阳性等。

4、实时重组酶聚合酶扩增技术(Real-time RPA) 

Real-time RPA，即时实时荧光定量 RPA，是 RPA 基础反应体系与荧光探针结合起来的一种联用 技术。与实时定量 PCR 比较，两者具有相同的灵敏度与特异性，然而实时荧光定量 RPA 的检测过程 所需时间明显短于实时荧光定量 PCR，即实时荧光定量 RPA 所需时间是 7～15 min，实时荧光定量PCR 则需耗时约 90 min，且荧光定量 PCR 的实验操作设备较复杂、昂贵，而且所占空间大、不便携 带。

此外，实时荧光定量 PCR 不仅 需要一个热循环过程而且实验操作步骤复杂，而实时荧光定量 RPA 实验操作温度在 37～42 ℃ 的恒温条件下就可进行，不需复杂的操作程序。用双标记寡核苷 酸探针检测目标扩增，该探针的 5’末端含有荧光基团 Tamra 或 FAM)，3’末端含有猝灭基团。当探针 与被扩增的靶 DNA 结合时，外切酶 III 切割基本位点，荧光基团和猝灭基团被分离，从而产生出与扩 增目标 DNA 数量成正比的荧光信号，荧光强度也会随着其扩增而增强。荧光强度信号实时检测由 荧光信号检测器或扫描仪完成，目前有针对荧光定量 RPA 技术的简易便携荧光检测设备。

该技术敏感性强、特异性高，检测时间短，已有不少报道利用该技术建立食品安全快速检测的方法。

三、RPA 技术在食品安全检测领域的应用 

目前，RPA 技术在国内外已经有大量的报道，涉及食品安全检测以及临床诊断等方面，并且在快 速便捷检测等方面优于 PCR 检测。RPA 技术在食品安全领域的应用主要包括食源性病毒、食源性致 病菌、动物源性成分及转基因成分检测等方面。

1、食源性致病菌的 RPA 检测 

沙门氏菌是引起世界各地食源性疾病暴发的最常见病原，许多流行病学调查将沙门氏菌爆发的源 头归咎于家禽和家禽副产品，包括蛋类。GAO 等建立了一种快速检测贝类中沙门氏菌的 RPALFD 检测方法，在 30～45 ℃下，仅需要 8 min 的扩增就能达到扩增子的检测阈值。

该方法具有良好的特异性，每次反应都能达到 100 fg DNA（20 μL）的灵敏度。且不需要昂贵的设备，可作为野外条 件下贝类和其他食物中沙门氏菌的检测试剂盒。KERSTING 等将芯片技术与 RPA 技术结合，建立 了一种能够在芯片表面检测淋球菌、肠道沙门氏菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，酶反应在 20 min 完成，检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌 10 个菌落形成单位和淋球菌 100 个菌 落形成单位，该方法对于护理点检测和基于核酸的简化和小型化诊断是有效的。KIM 等以牛奶为 研究对象，建立了 RPA 方法检测其中的沙门氏菌，5 min 后裸眼观察检测结果。

整个实验过程在 30 min 即可完成，得出牛奶中的沙门氏菌检出限为 100 CFU/mL（每毫升样品中含有的细菌菌落总 数），再次印证了 RPA 具有高灵敏度的特点。LIU 等以牛奶和鸡胸肉为研究对象，建立了一种 RPA-LFD 快速检测方法，检测样品中的沙门氏菌，并与 PCR-LFD 的检测结果比对，结果显示 RPALFD 的检出限为 1.05×10 CFU/mL，而 PCR-LFD 的检出限为 1.05×105 CFU/mL，因此 RPA-LFD 的 检出限比较低，灵敏度高。由此可见，RPA 技术能够为食源性致病菌的检测提供一种简便的方法。

2、食源性病毒的 RPA 检测 

食源性病毒指以食物为载体并经粪口途径传播而导致人类感染、患病的病毒。作为食源性疾病的 重要病原体，微量的病毒即可引起相关疾病的发生，其中不乏传染性强、流行范围广、危害严重的疾 病。WANG 等基于 RPA 技术结合侧流层析技术 LFD 建立了一种检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法。

在 38 ℃条件下，用特异性引物和探针，在 20 min 成功扩增了口蹄疫病毒基因组 2B 基因的一个 区域。该方法进一步验证了 RPA 技术具有操作简便、特异性好、灵敏度高等的优点，且不需复杂仪 器，适用于基层实验室和现场的口蹄疫病毒快速筛查检测。YEHIA 等开发了用于检测 H5 亚型流感 病毒的血凝素基因的定性逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）测定法。将结果与实时逆转录聚合酶 链反应（RT-PCR）进行比较，前者在 7 min 能完成检测，而后者至少需要 90 min 才能完成。

总之， RT-RPA 比 RT-PCR 更快，并且易于在便携式设备中操作。而且，它们具有同等的敏感性和特异性。AHMED 等以家禽及肉制品中 H7 和 N9 亚型流感病毒为研究对象，建立了反转录实时荧光定量 PCR（RT-qRPA）方法。该方法分别可最低检测到 10 个 H7 亚型病毒 RNA 或 100 个 N9 亚型病毒 RNA，进一步表明 RPA 技术具有高灵敏性的优点。食源性病毒威胁人类健康，因此其检测对食品安 全体系的完善具有重要的意义。RPA 检测方法的建立为食源性病毒的检测提供了新的方向。

3、肉类掺假检测 

肉类食品是人们生活中最重要的生鲜类食品之一，随着生活水平的提高，对肉品质的需要也越来 越高，近年来，国内外市场上的肉制品掺假事件频繁发生，这些不法行为不仅破坏了公平贸易，给消 费者带来经济损失，更重要的是引起了宗教信仰、食品安全等方面的问题。郭燕华等根据猪源线粒 体细胞色素 B 基因序列设计了 2 对 RPA 引物，筛选了 1 对可用于扩增的引物，建立了基于重组酶聚 合酶介导的等温核酸扩增检测方法，结果显示，30℃温扩增条件下，RPA 引物的特异性良好，检测灵 敏度可达 0.1 ng/μL 该方法快速简便，具有较高的特异性和灵敏性，适用于快速检测市售生鲜肉中的 猪源性成分。吴昊等根据家猪线粒体细胞色素 B 的核苷酸序列建立了一套利用 Real-time RPA 技术 进行肉及肉制品中猪源性成分的检测方法。此方法能够检测出肉及其制品中低至 0.2%的猪源性成 分，且能够在恒温的条件下(40℃)15 min 内完成反应，是一种新型、简单、高效的检测方法，对实现 快速便携式的猪源性成分检测具有重要意义。综上所述，RPA 技术在动物源性检测方面具有简单高效 等优点，为市售生鲜肉制品掺假提供了快速便捷的检测方法。

4、转基因检测 

随着转基因技术的不断发展，其在农业技术方面的应用也越来越广泛，转基因食品也走向市场， 在转基因食品的监测方面，监管部门也面临越来越大的压力。贾玄等针对转基因水稻建立了一套利 用 RPA 技术的检测方法，包括 RPA-Basic、RPA-LFD、实时荧光定量 RPA（RPA-Exo）,结果显示， 该检测方法相较于传统的 PCR 具有更高的灵敏性，检测速度方面也优于传统 PCR，在 15~40 min 能 够检测出结果。李凯等以转基因玉米 TC1507 以及 MON89034 两个品种为研究对象，在实时荧光 定量 RPA 检测方法的基础上，建立了双重 RPA 检测方法，结果显示，RPA 荧光检测方法可以对这两 种转基因玉米进行双重检测。XU 等基于花椰菜花叶病毒 35S(camv-35s)启动子和农杆菌 NOP 合成 酶基因(NOS)终止子等在转基因作物中的调控序列，设计了两套 RPA 引物，建立了用于转基因作物筛 选和检测的实时 RPA 检测方法。该方法可在 15～25 min 可靠地检测出样品中的 100 个拷贝的目标分 子。此外，还成功地将实时 RPA 检测方法用于 4 种主要转基因作物(玉米、水稻、棉花和大豆)的 DNA 扩增和检测。这种新的扩增方法大大缩短了检测时间，简化了反应过程，为转基因作物的快速 检测提供了一种有效的方法。

DILIP 等以转基因 RR2Y 大豆为研究对象，建立了一种 RPA 的现场 检测方法，以大豆样品中内源 Lec 基因作为对照，反应开始后大约 5～7 min 的检测时间内，Lec 调控 的反应在所有情况下均产生阳性信号。

研究表明，这种现场检测方法同样适用于未经训练的人员对样 品进行快速简单的测试。RPA 技术为转基因食品的检测提供了快速便捷的方法。

四、过敏原基因检测 

随着食品行业的发展，过敏食物的增多，过敏性疾病已经成为全球性的问题，并引起各界广泛的 关注，据报道，约有 90％的过敏反应是由花生、鸡蛋、牛奶、果仁、贝类、大豆和小麦引起的，其中以花生为过敏原引起的过敏反应最为严重，SANTIAGO-FELIPE 等建立了一种 RPA－ELISA 检测技术，同时检测榛子、花生、大豆、番茄和玉米中的过敏原结果表明，每个分析物的检出限为 1.3～5.3 μg/g，与 PCR-ELISA 的灵敏度和重复性相比，RPA-ELISA 都优于前者，且 RPA-ELISA 技 术更适合应用于偏远地区等资源匮乏的环境。 

JAUSETRUBIO 等以羽扇豆为研究对象，建立了核酸适体一重组酶聚合酶等温扩增扩增(Apta-RPA)的方法，利用选择的 DNA 适体的亲和力和特异性， 对抗过敏性 β-凝集素过敏原进行等温扩增超灵敏检测。将磁珠作为固相与 Apta-RPA 检测相结合，总 测定时间从 210 min 减少到仅 25 min，检测限为 3.5×10-11mol/L，证明了快速和超灵敏的通用方法可 以与任何适配器一起使用。RPA 方法的建立为食品中过敏原的检测提供了新的思路。

五、结论

RPA 等温扩增技术具有许多优点。这种反应没有热循环的需要，可使用简单设备，如加热器或烤 箱，价格低廉，可以进行最低限度的维护控制。具体来说，RPA 具有恒温、较低温度、扩增时间短、可靠性和简单性等特点。核酸扩增产物的测定还具有灵敏度高等优点，在食品安全检测领域具有一定 的应用价值。

它提供了一种能够检测潜在食物威胁因素的方法，如过敏原、转基因生物或病原体。传 统检测技术由于耗时长，设备复杂，因此不利于现场快速检测，已不能满足食品安全检测的更高需 求，因此建立一种快速便携、灵敏、特异的检测方法十分重要。RPA 作为一个新兴的分子检测技术， 迄今为止，不仅在医药学等方面应用较多，而且在食品安全检测方面的研究也初有成效，随着 RPA 技术不断地应用与研发，未来 RPA 将朝更加快速、便携、敏感、特异的方向发展，给食品安全检测 的研究带来新的曙光。