栽培花生(Arachis hypogaea L.)，又称为花生，是一种重要的豆科植物，全球花生产量超过4398万吨，其果实可用作食用坚果、做食用油、花生酱、糖果等。中国和印度是两大花生生产国。

花生中最主要的一种病害是青枯病，是由青枯雷尔氏菌引起的。该病原菌通常感染植物的根部，然后通过维管束传到地上部分。如果这些细菌繁殖到一定程度，植物就会出现萎蔫症状甚至死亡。青枯病是花生生产国中的毁灭性病害，在我国13个主要花生生产省份中已被发现，并可能造成高达50-100%的产量损失。通过选育具有稳定抗性的花生品种是防治青枯病最有效的途径。通过常规育种培育了几十个抗病品种，并广泛用于花生生产。它们的抗性在植物中是最稳定和最持久的。

关于花生抗青枯病的遗传机制目前了解得很少，通过了解控制性状的遗传机制，找到候选基因，可以开发分子标记，用于基因组辅助育种，将极大地缩短育种时间，培育抗病品种。由于栽培花生(AABB，2n=4x=40)的A、B亚基因组具有很高的相似性，花生基因组大(~2.7Gb)，分子标记多态性低，因此用传统分子标记覆盖整个基因组具有挑战性大、耗时和劳动强度大等特点。因此需要更有效的策略快速定位抗青枯病的QTL，通过基因组辅助育种(GAB)，加快培育优良品种进程。

QTL-seq是一种结合了BSA及高通量测序的方法，能够快速进行QTL定位。该方法只需要对2个亲本及2个子代混池进行测序，具有高效、成本低的特点，已在豌豆、花生、鹰嘴豆等多种物种上得以应用。本研究使用QTL-seq方法对花生青枯病抗性进行了研究。

材 料

由抗病亲本Yuanza9102(RP)与感病亲本Xuzhou68-4(SP)构建的RIL群体(含195个个体)。用收获前的存活率评估其抗性。从中选取15个最低存活率的植株(2.15-11.54%)构建感病混池SB；选取存活率最高的15个(92.96%-100%)构建抗病混池。

测 序

对2个亲本及2个混池的DNA分别构建了~350bp文库，采用Illumina NovaSeq 6000进行测序，两个亲本SP、RP测序数据分别为82.25Gb、68.99Gb；两个混池SB、RB的测序数据分别为111.7Gb、110.17Gb。

研究结果

01

将reads与亲本比对鉴定SNPs

将两个混池的reads比对到SP的参考序列，抗病、感病混池的覆盖度为93.15%、93.04%；鉴定到164,522个SNPs；使用RP序列作为参考序列，抗病、感病混池的覆盖度为93.09%，92.98%；得到243,380个SNPs。

02

抗青枯病的候选区域鉴定

使用鉴定到的SNP计算了SB、RB的SNP-index，并得到了ΔSNP-index。通过滑窗分析，将SNP-index显著偏离0.5及ΔSNP-index显著偏离0的区域定位为候选区域。

本研究使用SP序列作为参考序列，在B02染色体上定位到候选区间，长度为3.35Mb(3.25-6.60Mb)；使用RP序列作为参考序列，定位到了2个候选区间，分别为B02上的3.25-6.90Mb区域及B09染色体上13.55-16.40Mb区间内的2.85Mb。

03

通过遗传图谱确认鉴定的候选区域

为了验证并缩小B02上的候选区域，对28个ΔSNP-index较高的SNP开发了KASP标记，用这些标记对RILs群体进行基因分型并构建了遗传图谱，图谱长度为38.14cm。并采用复合区间作图法对3个环境下记录的表型值进行了QTL定位，LOD值在6.53-17.23，表型解释率为14.4-29.32%；单标记分析法也证明了3个标记和青枯病抗性存在显著关联。因此，将B02上的候选区间缩小到了2.07Mb(3.74-5.81Mb)。对B09上的候选区间开发了8个KASP标记进行验证，构建图谱长度为4.86cm；但复合区间作图法及单标记分析法都证明该区间没有稳定且主效QTL；结合之前基于SSR标记研究鉴定到的5个QTLs,在B09上没有鉴定到QTL，因此认为B02上的2.07Mb区域含有抗青枯病的稳定的主效QTL，且抗性等位位点来自于Yuanza9102。

图1 花生中青枯病抗性鉴定的QTL-seq流程

04

青枯病抗性的候选基因

在这2.07Mb区域中，有348个有效SNPs，其中246个是使用两个亲本做参考序列都能鉴定到的；76、26个分别是用其中一个亲本做参考序列鉴定到的；有49个非同义突变SNPs，有19个候选基因。

在这19个发生非同义突变的基因中有7个能编码NBS-LRR型的抗性蛋白，包括Araip.G1MIP, Araip.VE4DY, Araip.05JB8, Araip.YCN52, Araip.U0YME, Araip.WF303 和Araip.65IVT。

图2 鉴定的与青枯病抗性有关的NBS-LRR抗性蛋白

05

诊断标记的验证

用位于B02上2.07Mb基因组区域上的3个SNP标记对21个抗病材料和9个感病材料进行验证(材料由抗病品种Yuanza9102和感病品种Zhonghua5杂交得到)。有2个标记(Araip_B02_3740746 和 Araip_B02_5804063)能够将抗病材料和感病材料分开。标记Araip_B02_3740746在抗病亲本中扩增出来CC等位基因型，在感病亲本中扩增出AA等位基因；第二个标记Araip_B02_5804063在抗病亲本中扩增出GG等位基因型，在感病亲本中扩增出TT等位基因型。所有21个抗病材料都为CCGG基因型，而9个感病材料为AATT基因型。然后对由Yuanza9102与其它两个抗病亲本得到的2个抗病材料进行鉴定，发现他们都含有CCGG基因型；而对其它的13个感病材料和13个抗病材料进行鉴定，发现他们都扩增出了AATT基因型。说明来自于Yuanza9102的抗性等位基因可能与其它13个抗性材料的不同。

然后根据这两个标记将RILs群体分成了CCGG、AATT基因型的两类，发现59个CCGG型的材料的平均存活率为74.45%，要显著高于78个AATT型的(34.17%)。表明来自Yuanza9102的抗性等位基因能够显著提高花生青枯病抗性。通过上述研究，表明Araip_B02_3740746、Araip_B02_5804063这两个标记对于培育具有青枯病抗性的材料是有用的。

图3 青枯病抗性诊断标记的验证

本研究亮点

1、使用了2个亲本的参考序列对2个混池进行分析，提高了定位的准确性；结合连锁分析，进一步验证了定位结果并缩小了候选区间。

2、成功定位到了青枯病的候选区域，且开发了诊断标记，有利于加快花生抗青枯病品种的分子育种。