截至2019年11月，FDA累计批准了30款全人源抗体药物，其中有21款来自转基因小鼠技术，9款来自噬菌体展示技术。

技术引领革命，抗体库展示技术、转基因小鼠技术、人单B细胞筛选技术已经成为目前全人源抗体药物研发的三大技术体系。

后来居上

库展示技术建立最早，2002年创造了药王Humira的神话，之后库容量不断扩充，如今库展示技术抗体多样性已经达到1011数量级。然而由于库展示技术完全在体外完成，缺少体细胞突变、抗体亲和力成熟的过程，而该过程是产生高亲和力抗体的主要进化机制，因而库技术产生的抗体往往需要后续复杂的抗体工程化改造。

基于二代测序技术的发展，人单B细胞测序技术成为一种开发全人源抗体的方法。该技术从天然存在的人B细胞库中筛选“天然全人源抗体”，理论上能产生最接近人的抗体、具有更低的免疫原性，但也意味着对自身抗原的抗体筛选成功率较低，更适合针对一些病毒、细菌等病原微生物的外源靶点。

全人源抗体转基因小鼠技术则在抗体药物领域最大限度地发挥了转基因技术的想象力和创造力！该技术是将小鼠的免疫球蛋白基因组进行人源化改造，让人源抗体基因替代鼠源抗体基因在转基因鼠中表达，通过免疫这种转基因小鼠就能够针对不同抗原产生相应的全人源抗体。由于小鼠识别抗原和动员抗体的体内系统保持完整，容易把人体蛋白识别为异物，更适合开发肿瘤、自身免疫性疾病等人内源靶点。又因为转基因动物来源的抗体经历了完整的体细胞突变和亲和力成熟过程，抗体优化是通过DNA高频突变在小鼠体内自然完成的，在抗体亲和力和成药性方面具有很大优势，因此节约了后期抗体工程化改造的时间。

在全人源抗体药物研发策略中，转基因小鼠技术后来居上用实力见证了自身的价值。以Medarex的HuMAb技术平台为例，累计获批了10个抗体药物，年销售额200多亿美元；Abgenix的Xenomouse小鼠，累计获批了6个抗体药物。全人源抗体转基因小鼠在创造巨额利润的同时，也分别以天价被收购。2006年，安进以22亿美元的价格收购Abgenix，2009年，百时美施贵宝以24亿美元的价格收购了Medarex，然而在今天看来它们的价值还是被低估了。

全人源抗体转基因小鼠技术平台的价值之所以如此之高，一方面由于它是一种高效、快速的全人源抗体研发技术，能够产生巨额商业利润；另一方面源于该技术的稀缺性，由于技术壁垒高，到目前为止仅有少数几家公司掌握。该技术的高壁垒难以逾越，一方面源于技术体系本身的难度系数极高，已经达到目前科学水平的极限，另一方面则受限于难以突破现有专利的严密保护。

专利之争

知识产权是商家必争之地，同样，转基因小鼠技术创造巨额商业价值的同时，也伴随着激烈的专利之争。自该技术诞生以来，所属公司从技术策略、序列、位点等各个角度进行了严密的专利布局。二个技术相近的专利之争，往往不是你死就是我活，要么寻求和解，要么被迫出局。

全人源抗体转基因小鼠平台的成功建立需要经历两个阶段：在第一阶段中，首先要将小鼠的内源免疫球蛋白基因失活；第二阶段，将人源免疫球蛋白基因导入小鼠基因组中，使之能够稳定遗传并高效表达。

HuMAb和Xenomouse专利之争的焦点在于第一阶段，使小鼠的内源免疫球蛋白基因失活的策略。两家公司均采用了敲除小鼠heavy-chain 中的铰链区（J区）基因片段的策略，从而导致VDJ不能发生重排，使鼠源抗体无法生成。从1994-1997年两家公司陷入了长达3年的专利纠纷，官司走向的不明朗和专利归属权的不确定性不但阻止了公司上市，也严重限制了吸引新的融资和合作，这次官司几乎让GenPharm（HuMAb原研公司）解体，如果那样我们就看不到今天的Mederax和它的10个上市单抗了。直到1997年两个公司签订了专利交叉许可协议，双方在知识产权上不再有任何法律纠纷，都承认对方在转抗体基因小鼠技术上专利的合理性。

另一场专利之争发生在Regeneration和Kymab公司之间。从技术策略看，Veloclmmune mouse和KYmouse专利之争的焦点在于第二阶段，即将人源免疫球蛋白基因导入小鼠基因组的策略。两家公司均采用定点敲入的策略首先将最小VDJ片段插入小鼠heavy-chain 中的C区上游，然后分次导入更多的V区。Kymab分别分5次导入917kb IGH, 838kb IGK和 932kb IGλ。Regeneration分9次和8次导入1Mb IGH和0.5Mb IGK。Regeneration和Kymab在这起专利之争中互有胜负，2016年Kymab公司赢得第一个回合，2018年Regeneration在第二回合中胜出。

Regeneration的Veloclmmune mouse技术策略

Kymab的KYmouse技术策略

技术策略

全人源抗体转基因小鼠技术之所以诞生以来一直官司缠身，主要原因是技术体系和方法有限。将小鼠的内源免疫球蛋白基因失活，有以下几种不同的策略：

策略1

将鼠免疫球蛋白基因重链和轻链的J区敲除，该策略的原理是通过阻断VDJ重排过程，阻止小鼠内源性抗体生成，如 HuMAb和Xenomouse。

策略2

将小鼠免疫球蛋白基因重链VDJ区倒置，扰乱顺式作用元件与编码区的调控作用，阻止小鼠内源性抗体生成，但是小鼠内源V、D、J区仍然存在，如Kymouse.

策略3

在小鼠免疫球蛋白基因上游的调控区插入转录终止元件stop cassette，关闭基因转录，阻止小鼠内源性抗体生成，但是小鼠内源V、D、J区仍然存在，如OminiRat/Mouse、 H2L2 Tg Mice。

策略4

将小鼠免疫球蛋白基因重链V、D、J，轻链V、J区全部敲除，是最彻底的阻断鼠源抗体生成的策略，完全避免了鼠源抗体基因表达泄露、灭活不充分的风险，如Veloclmmune mouse。

将人源免疫球蛋白基因导入小鼠基因组则更难，如果基因导入的技术策略相似，导入的人源抗体基因的序列和敲入位点也基本相似，则很容易产生专利纠纷。为了使导入小鼠基因组的人免疫球蛋白基因正常表达，各公司基本采用了将人源基因在C区上游定点敲入、或将小鼠的同源基因原位替换的策略，以保证基因表达调控不受影响。

然而人免疫球蛋白基因相当庞大，IGH 约2Mb，IGK 约2Mb，IGλ 约1Mb，无论是采用同源重组还是位点特异性重组，都受到重组载体容量的限制。大多数公司采用的基因导入载体是BAC/YAC，BAC的容量在100kb，YAC的容量在1Mb，如果采用同源重组基因敲入策略，每个重组载体两端还要保留足够长的同源序列，想要将全部人免疫球蛋白基因导入小鼠基因组，就成为一项极限挑战！目前该记录的保持者是Regeneration通过9次基因打靶导入大约1.0Mb人IGH，其中包含了绝大多数的80个VH区，和几乎全部的DH和JH区。但这仍不是全部的人 VH-DH-JH序列，除了未导入人的CH区，还删掉了一些功能未知的间隔序列。

另辟蹊径

全人源转基因小鼠平台的建立是一项巨大的工程，由于抗体开发能力依赖于产生抗体的多样性，抗体多样性越高，产生高亲和性、高成药性的抗体的概率也会越大。而抗体多样性的基础依赖于导入的人免疫球蛋白基因的长度和完整程度，也就是导入的人抗体基因序列越长，基因结构越完整，产生的抗体多样性越多，越接近人抗体。因此各公司在导入序列的长度上不断加长，各小鼠平台也在不断升级。一个较为成熟的转基因小鼠平台通常会耗时5-10年。

人免疫球蛋白基因结构

为了突破序列长度的限制，日本科学家另辟蹊径以染色体为载体，将完整的人抗体基因座组装到外源染色体中，转入小鼠细胞核。使小鼠携带了人免疫球蛋白基因完整的调控区、编码区、间隔序列，能够实现100%全人源。该技术被称为转染色体技术（trans chromosome technique)。技术原理如下：将天然染色体中的基因区去掉，保留中心体和端粒，以此作为染色体工具载体，将完整的人免疫球蛋白基因座插入该载体中，采用微小核融合技术（MMCT）将重组的染色体融合入小鼠胚胎干细胞中，发育为携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，再与鼠源抗体基因缺陷的小鼠杂交，获得的全人源抗体转基因小鼠被成为TC mouse，这一全新的转染色体技术也让TC mouse成功避开了专利纷争，在全人源抗体转基因小鼠中独树一帜。

转染色体技术原理

主要参考文献

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5.Nat Biotechnol. 2014 Apr;32(4):356-63. Complete humanization of the mouse immunoglobulin loci enables efficient therapeutic antibody discovery.Lee EC1, Liang Q1, Ali H1, Bayliss L1, Beasley A1, Bloomfield-Gerdes T1, Bonoli L1, Brown R1, Campbell J1, Carpenter A1, Chalk S1, Davis A1, England N1, Fane-Dremucheva A1, Franz B1, Germaschewski V1, Holmes H1, Holmes S1, Kirby I1, Kosmac M1, Legent A1, Lui H1, Manin A1, O'Leary S1, Paterson J1, Sciarrillo R1, Speak A2, Spensberger D1, Tuffery L1, Waddell N1, Wang W2, Wells S1, Wong V1, Wood A1, Owen MJ1, Friedrich GA1, Bradley A3.

6.Neutral Citation Number: [2016] EWHC87 (PAT). THE HON MR JUSTICE HENRY CARR. Between : Regeneron Pharmaceuticals Inc and Kymab.

7.United Kingdom Patent Decisions 2018. IIC - International Review of Intellectual Property and Competition Law March 2019, Volume 50, Issue3, pp 331–351