CRISPR-Cas9等基因编辑工具在消除疾病和遗传疾病方面具有巨大的应用潜力。将突变基因替换为正常基因有可能成为未来医生治疗患者的重要手段。类器官是可以在实验室中生长的微型器官。目前，类器官在生命科学研究中应用广泛，其在发育生物学、病理学、细胞生物学、精准医疗以及药物毒性和药效试验等领域都有着巨大的应用潜力。通过改变不同类器官的基因可以极大地帮助研究生物学过程和疾病建模。然而，到目前为止，由于缺乏简单的基因组工程方法， 基因组编辑人类类器官的构 建比较困难。

近日，来自荷兰Hubrecht研究所的Hans Clevers研究团队开发了一种CRISPR-Cas9介导的不依赖同源性的新遗传工具CRISPR-HOT。该方法可标记人类类器官中的特定基因，简化了类器官的基因组编辑过程，为类器官可视化研究提供了可靠的基因编辑方式。 研究人员利用这种新方法分析了肝细胞如何分裂以及DNA过多异常肝细胞是如何出现的，并发现敲除 癌症基因TP53，异常肝细胞的非结构化分裂会更频繁。以上发现或有助于深入研究相关癌症的发展过程。3月2日，该研究结果发表在Nature Cell Biology上。

DNA损伤可以激活细胞中两种不同的修复机制，即同源修复（HDR）和非同源末端接合（NHEJ）。利用这两种修复机制可以迫使细胞在特定的位置插入新的DNA片段。其中一种方法就是“非同源末端连接”。该方法被认为经常出现错误，因此并不经常用于 新DNA片段的 插入 。 但此前针对小鼠的一些研究表明，新的DNA片段可以通过非同源末端连接方式实现有效插入。

图2.不同修复策略比较，来源： Nature Cell Biology

因此，研究团队开始在类器官中进行检测。研究发现，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的非同源末端连接方法，可以将任何DNA片段插入到类器官，并且比迄今为止使用的其他方法都更有效、更稳健。研究团队将这一新方法命名为CRISPR-HOT，经过比较验证，该方法是一种具有通用性、高效且强大的独立于同源性的非同源末端连接方法。

随后，研究人员利用CRISPR-HOT将荧光标记插入人类类器官的DNA中，使这些荧光标记附着在特定的靶标基因上。研究人员首先标记了肠道中非常罕见的特定类型的细胞：肠内分泌细胞。这类细胞通过产生激素来调节葡萄糖水平、食物摄入和胃排空。因为肠内分泌细胞非常稀有，所以很难研究。使用CRISPR-HOT方法，研究人员可以轻松地将这些细胞“涂成”不同的颜色，然后对其进行识别和分析。

图3.CRISPR-HOT可实现精确的基因敲入。 a，用于评估敲入事件准确性的实验装置示意图。 b，CRISPR-HOT主要在人肝细胞类器官中的两个不同基因座（TUBB和CDH1）上介导了精确的框内敲入。来源：Nature Cell Biology

此外，研究人员还标记了源自肝脏中特定细胞类型（胆管细胞）的类器官，并使用CRISPR-HOT对角蛋白（参与细胞骨架的蛋白质）进行了可视化，进而以高分辨率查看角蛋白的详细信息。同时，研究团队以一种超微结构的方式解析了角蛋白所在的组织，发现当细胞特化或分化时，这些角蛋白也会改变表达。因此，研究人员认为，CRISPR-HOT或可用于研究细胞命运和分化。

在肝脏中，有许多异常肝细胞含有的DNA是正常细胞的两倍（甚至更多倍）。目前尚不清楚这些DNA数量异常的细胞是如何形成的，以及能否分裂。此外，老年人体内含有更多的这种异常肝细胞，但目前尚不清楚这是否与癌症等疾病有关。

图4.使用CRISPR–HOT生成人肝导管报告器官类器官系。 a，人肝导管类器官的转染和敲入生成策略。 b，标记KRT19基因座和sgRNA。 低倍和高倍镜下培养物的荧光图像。来源：Nature Cell Biology

研究团队利用CRISPR-HOT标记了肝细胞类器官中细胞分裂机制的特定成分，并研究了细胞分裂的过程。结果显示，正常肝细胞的分裂非常有序，总是沿某个方向分裂为两个子细胞。 该研究发现了形成异常肝细胞的几个区域，并 第一次观察到正常肝细胞如何转变为异常肝细胞。 除此之外，研究人员还研 究了肝癌中常见的TP53基因突变对肝细胞异常细胞分裂的影响。 发现敲除TP53基因，异常肝细胞的分裂频率会更高。 研究人员认为，这可能是TP53促进癌症发展的 方式之一。

图5. (左) 健康类器官有组织的分裂； (右) 肿瘤基因TP53被破坏的类器官 细胞分裂 混乱。 来源： Nature Cell Biology

图6.肝细胞类器官中肝细胞分裂的不同方式， 来源： Nature Cell Biology

综上所述，CRISPR-HOT是一种通用方法，可在类器官中实现快速有效的基因敲入。经验证，该方法适用于不同类器官模型，例如衍生自诱导多能干细胞和胚胎干细胞的类器官。虽然使用常规方法已经成功实现了敲入，但基于非同源性的方法或可提高敲入的效率。此外，CRISPR-HOT在需要生成报告基因系、蛋白质标签、细胞结构标记和谱系追踪实验的研究中也是一种有潜力的方法策略。未来，CRISPR-HOT或可应用于多种类型的人类类器官，用于可视化任何基因或细胞类型以及与发育和疾病相关的研究问题。