摘要：病毒可以感染细胞，在细胞中完成复制和翻译的过程，因此也可以将病毒作为一种高效的基因转移系统，即病毒载体。目前最常用的病毒载体有慢病毒（Lentivirus，LV）载体，腺病毒（Adenovirus，AdV）载体和腺相关病毒（Adeno-associated virus）载体等。传统的病毒载体主要应用于构建细胞系和表达蛋白，随着分子生物学领域的不断进步，病毒载体在疫苗、基因治疗和细胞治疗等领域也大放异彩。本文着重介绍了几种常用的病毒载体在疫苗和基因治疗领域的应用，简述了其生产的大致流程。

一、病毒载体在疫苗领域的应用

作为疫苗的病毒载体种类很多，本部分简介了其中三种最为常用的病毒载体，分别是慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

1.慢病毒载体

慢病毒载体是以HIV（人类免疫缺陷病病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，能有效的感染包括神经元细胞在内的多种类型细胞，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组为正链RNA，进入细胞后反转录成DNA，整合进细胞基因组中，从而实现目的基因在细胞内长期、稳定的表达。慢病毒载体删除了HIV病毒的绝大多数基因，仅保留了HIV病毒的LTR、包装新号、Rev应答原件等，因此免疫原性低，几乎不引起细胞免疫和体液免疫反应，不影响病毒的二次注射。

图1：第三代慢病毒载体

慢病毒载体是目前正在开发的许多需要转移遗传物质的临床技术，尤其针对非增殖细胞和增殖缓慢的细胞格外具有吸引力，例如CD34⁺干细胞。慢病毒载体在临床研究中的首次应用是使用慢病毒载体靶向HIV包膜基因的反义RNA，以治疗HIV的感染。随后，慢病毒载体被用于治疗几种遗传性疾病。

图2：临床研究中的慢病毒载体

2.腺病毒载体

腺病毒是一种没有包膜的双链DNA病毒，人腺病毒已知有49种，腺病毒载体由腺病毒基因改造而来，常用的是人2型和5型腺病毒载体。腺病毒载体系统可以广泛的表达人类及非人类的蛋白，感染多种哺乳动物细胞，且在已知的多种细胞中都不会整合进染色体中，因此也不会干扰正常基因。

自20世纪80年代发展以来，腺病毒载体在基因传递中的应用大大增加，全球已经批准超过2000项腺病毒载体相关临床试验，部分用于基因递送的临床试验实例在表2中显示。腺病毒载体疫苗主要应用在癌症领域，通过病毒的自然生命周期进行天然的溶瘤，包括头颈癌，前列腺癌，结肠癌和乳腺癌等。

表1：部分使用腺病毒载体的临床试验

3.腺相关病毒载体

腺相关病毒属于细小病毒科，单链DNA病毒。经过改造的腺相关病毒被广泛应用在动物水平的基因表达和基因治疗中。腺相关病毒是迄今为止发现的一种结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，通常需要在其他病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）的辅助下才会产生感染，生成子代病毒。

利用腺相关病毒载体可以治疗多种疾病，包括阿尔兹海默病、关节炎、囊性纤维化、艾滋病感染、帕金森和多种癌症(主要是抑制血管生成和导入自杀基因)。虽然这些研究大多都只限于动物实验阶段，但应用于人体已经显示出可喜的前景。

表2:三种常用病毒载体对比

二、病毒载体在基因/细胞治疗领域的应用

基因治疗（Gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，纠正或补偿缺陷或异常基因引起的疾病，以达到治疗的目的，根据给药途径可分为离体（Ex vivo）和在体（In vivo）基因治疗两种（如图3所示）。

图3：基因治疗原理示意图

细胞治疗（Cell therapy）是指将正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以代替受损细胞，或具有更强的免疫杀伤能力，从而达到治疗疾病的目的。按细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。

图4：嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）原理示意图

中国是全世界第一个批准商业基因治疗的国家。2003年，深圳赛百诺基因技术有限公司研制成功的、拥有自主知识产权的药物“金又生”（Gendicine）获批上市，成为世界上首个被批准上市的基因治疗药物。“金又生”的上市，引起了全世界的广泛关注，被誉为基因研究和生物高技术领域新的里程碑。2012年，荷兰uniQure公司研发的基因治疗药物Glybera在欧洲有条件上市，用于治疗脂蛋白酯酶缺乏症（LPLD），成为欧洲第一个获批的基因治疗产品。美国第一个批准上市的基因治疗药物是基于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immuno Therapy， CAR-T）疗法的Kymriah，用于治疗B细胞恶性肿瘤。2003年以来批准上市的基因治疗及细胞治疗相关产品总结在表3中。随着基因治疗领域的快速发展，以前医学无法治愈的一些疾病有望得到根治。

表3：已上市的基因治疗及细胞治疗相关产品

三、病毒载体产品生产工艺流程

以腺病毒载体相关产品的生产工艺为例，腺病毒载体相关产品的工艺流程如图4所示。为了获取高滴度，高纯度且更加稳定的重组病毒，通常需要以下几个步骤：（1）制备高纯度，低内毒素含量的质粒；（2）使用摇瓶或反应器大量培养HEK293细胞；（3）包装成功的腺病毒感染293细胞；（4）收获病毒颗粒；（5）层析纯化并过滤除菌以得到病毒颗粒。

图5：腺病毒载体产品工艺流程示意图

基因治疗产品使用的病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等，其生产流程大同小异。工艺的快速研发以及稳健放大离不开可靠的硬件平台，小编在此推荐使用Cytiva公司的病毒/质粒研发生产平台，病毒/质粒研发及生产平台布局如图5所示：

图6：Cytiva公司病毒/质粒研发及生产平台布局示意图

四、全文总结

近几年的研究表明，将病毒载体是一种安全、高效的基因递送的手段，在癌症免疫治疗、遗传性疾病等方面均表现出了相当大的治疗潜力，为以前很多不治之症找到了新的方向。我们相信，随着未来科技的不断进步，以病毒载体为核心的治疗手段一定会成为不可或缺的医疗方式。当一个又一个的病例被不断治愈，我们应该对病毒载体治疗的明天充满希望，病毒载体治疗也一定会在医学领域大放异彩。