T细胞亚群及表型特征影响
细胞毒性CD8+CART细胞，直接介导肿瘤细胞清除，但是CD4+辅助细胞(Th细胞)同样有着重要作用。CD4+和CD8+CART应该有一个合适的比例，有报道，治疗B-ALL中，1：1会获得产生更好的肿瘤消退疗效（3）。
调节性T细胞浸润到实体肿瘤局部，会降低CD28-CD3ζ信号通路活性。去除CD28CAR胞内段的Lck结合结构域，即使在调节性T细胞存在的情况下，也有强抗肿瘤活性（4）。
低分化的初始样T细胞（naïve-like T cells ，T N cells，表型CD45RA+ CD45RO- CD95-，CCR7+，CD62L+，CD28+，CD27+)和干细胞记忆样T细胞（Stem cell memory-like T cells ，T SCM cells，表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更强的增殖能力和自我更新能力，以及分化为效应和记忆T细胞的能力，因而有产生更好临床结果的潜能，更持久的抗肿瘤活性。
而分化的效应样T细胞（T effector-like cells，TEff cells，表型CD45RA+ CCR7-)虽然体外表现初强的抗肿瘤活性，但是在体内，活化和增殖等能力均受损。
肿瘤高表达免疫检查点配体，免疫细胞高表达免疫检查点受体，则病人对于CART缺乏应答。
T细胞需要表达淋巴组织归巢分子（CCR7和CD62L），有助于浸润到肿瘤局部，起到更好的治疗效果。如上文，T N 和T SCM 表达归巢受体，而T eff 不表达归巢受体。 高表达CXCR2和GD2也有助于CAR-T浸润到肿瘤组织。
生产工艺及优化
1. 细胞分离和富集
分离方法：传统方法Ficoll密度梯度离心用于去除颗粒细胞、红细胞和血小板；自动化的分离系统：Sefia Cell Processing System，CliniMACS Prodigy。
基于CD3+进行细胞分选，然后以磁珠为基础的技术如CliniMACS Prodigy，使用anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁珠分选或者去除特定的细胞群，以获得合理比例的CD4：CD8。
特定未分化的T N ，T SCM ，T CM 细胞对于临床是有益的(7)，但是分选流程复杂，在实际生产流程中有一定困难。
2. T细胞激活
2.1anti-CD3/anti-CD28抗体活化
使用抗CD3（OKT-3单克隆抗体）/抗CD28抗体包被磁珠作为人工抗原提呈颗粒，anti-CD3提供增殖信号，anti-CD28提供共刺激信号。活化之后，磁珠可被磁铁去除掉。
和可溶性OKT-3抗体相比，抗体包被磁珠活化细胞，具有更少的分化，更少衰老的特点。另外富集和清洗细胞会更加简单，昂贵抗体的丢失更少。因而磁珠法是生产工艺中最常用的方法，如诺华的Kymriah。
最近一种特殊的聚合物纳米基体产品(T Cell TransAct)，上面结合有人源化CD3和CD28抗体，结合使用无血清培养基(TexMACS)，用于T细胞活化。这种方法增加了高表达CD62L，CCR7的 T CM 细胞，减少CD57+耗竭T细胞，但是不改变PD-1的表达和基因转染效率，而且细胞裂解活性降低（8）。
2.2 Retronectin
Retronectin是另外一种活化策略，使用重组纤维连接片段，同时可以增加逆转录病毒的感染效率。Retronectin和板结合CD3抗体，或者anti-CD3/anti-CD28磁珠，用于GD2特异性CART和CD19特异性CART（9），增加T N 和T SCM 的比例。但是T细胞活化弱，扩增弱，细胞因子分泌少等是缺点。
2.3 人工APC细胞
人工APC递呈TAA给CART，使其活化。比如使用K-562同时表达TAA和共刺激分子，不表达HLA-A，HLA-B，仅可用于TAA特异性CART活化（10)。
3. 基因转导系统
3.1病毒转导
病毒转染系统转染效率高，最常用的是逆转录病毒载体和慢病毒载体。逆转录病毒将病毒DNA整合到宿主DNA中，产生稳定的转染。慢病毒需要调节基因来中和宿主细胞的防御，削弱免疫反应，以及调节病毒复制。慢病毒载体，插入诱变和致癌的风险很低。
逆转录病毒生产需要大量的包装细胞，而慢病毒载体生产需要大量质粒DAN进行瞬时转染。病毒的生产需要GMP级别的生产车间和一系列的检测方法，是病毒转染细胞最大瓶颈。
诺华的Kymriah® (Tisagenlecleucel)和 施贵宝Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使用慢病毒载体。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使用逆转录病毒。
3.2 基于质粒的基因传递
转座子/转座酶系统是一种替代的非病毒基因传递策略。采用“睡美人”转座子/转座酶系统进行CART制造。该系统由两个DNA质粒组成，一个编码CAR，第二表达转座酶，这是切除和插入转基因所必需的。这种方法不需要GMP车间生产病毒，成本低。在第一代CART和第三代CART中被使用，产品已经开始在临床实验中使用。
3.3 基因编辑
CRISPR/Cas9能够特异性地破坏多个基因的基因组基因座。CRISPR/Cas9系统结合腺相关病毒(AAV)载体，将CAR的DNA整合入T细胞受体a，提高T细胞效力，抑制T细胞分化和衰竭。使用基因编辑和慢病毒转导，用于产生PD-1缺陷的CD19特异性CART，增强抗肿瘤活性。
4. CART细胞结构
CAR结构包含
抗体的单链可变区（scFv）
非信号胞外区
与scFv链接的铰链区
跨膜区
T细胞受体胞内CD3ζ区
共刺激因子结构域
四代CAR的发展
第一代CART诱导T细胞激活仅通过cd3ζ信号域激活
第二代CART中增加了共刺激结构域
第三代CART增加两个共刺激结构域
第四代CART增加酶、细胞因子和共刺激配体
5. T细胞扩增
在CART细胞扩增过程中，细胞数量不断增加，培养基体积增大，必须通过更多或更大的组织培养瓶，这极大地复杂化了制造过程，并且它无法实现大规模的生产。
静态培养袋，允许较少的手动开放处理，管道连接可以使其在无菌条件下进行。
另一种方法 使用生物反应器，如Xuri细胞扩增系统和Wave生物反应器系统，利用灌注机制添加营养物质以及去除生长抑制物质，从而简化了制造过程。
6. 细胞因子刺激
细胞因子在工艺中使用，作为刺激信号，对于CART细胞质量，表型等产生重要影响。主要是γ链细胞因子：IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21。常用IL-2 或者IL-7,同时使用/或者不适用IL-15.
诺华Yescarta使用IL-2，但是IL-2会导致分化和耗竭的T细胞表型。IL-7/IL-15可以增强T细胞活化和增殖，二者联合使用可以增加未分化CART（T N ，T SCM） 的存活和维持。单独添加IL-15也会增加耗竭表型，及抗凋亡活性。
和IL-2和IL-15比较，IL-21可以增加CD62L表达，增加抗肿瘤活性（15）。
7. 抑制特定的信号通路
主要靶向GSK3β, mTOR, AKT, 和PI3K：
GSK3β阻断T细胞分化，产生更多的TSCM
mTOR inhibitor rapamycin增加CD62L表达
体外AKT抑制剂也表现出增加T细胞抗肿瘤活性（16）
PI3K抑制剂idelalisib，降低调节性T细胞，逆转肿瘤免疫耐受，增加低分化CART细胞数量（18）
8. 冷冻保存
冷冻保存CART细胞长达90天，不影响细胞的活力。使用前37℃过夜，可以恢复CART细胞活力（17）。
喵评：免疫细胞治疗的工艺随着大家对于免疫系统的深入研究，将来还会有更多的优化。
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