恶性肿瘤严重威胁着人类健康。发表于国际顶尖医学期刊《柳叶刀》的文章数据显示，1990至2017年间，肝癌始终占据我国人口主要死因的第5-7位，高于交通事故。 1 而2019年的一项统计数据表明，肝癌是我国第四高发的恶性肿瘤，死亡率位居第二。 2 在这样的背景下，切实有效地降低中国人群的肝癌发病率和死亡率，对于国民健康有着举足轻重的意义，同时也直接关系着每一个人、每一个家庭的幸福与平安。
近日，人民日报健康客户端和健康时报联合举办了“肝癌早诊早筛云端论坛”以及和瑞基因肝癌早筛新品“莱思宁”发布会，邀请到国内从事肝癌防、诊、治的多位专家共同探讨肝癌早诊早筛领域的前沿进展。在会上，中国工程院院士、国家肝癌科学中心主任王红阳指出，普及癌症早期筛查的对于降低肿瘤死亡率，延长患者生存期发挥着关键作用，癌症早筛的大规模推广与新药研发以及戒烟等公共卫生措施一起，使得美国25年来的癌症总死亡率下降了26%。对于我国而言，肝癌防控的战略需求和当务之急是探索适合中国人群的早筛早诊的新技术和新策略。
无限风光在险峰——突破肝癌早筛技术的效能瓶颈
与肝癌早筛早诊的美好愿望相悖的，是肝癌病因的高度复杂性和现有筛查技术的局限性。 王红阳院士指出，肝癌的发生有着复杂的因素，实现早防早诊早治必须要关注炎症向癌症的恶性转化，研究探索炎癌转化的临界点，解析复杂网络的关键节点。 肝脏的炎癌转化时间长、进程长、隐匿性高，早诊非常困难，所以非常需要早期预警和干预的方案。然而现行的超声加上甲胎蛋白的诊断方式，目前已经不被欧美国家指南使用，因为它们的灵敏度和特异性并不是非常高，例如甲胎蛋白检测的灵敏度仅为40-65%，所以急需新的早期预警和干预的手段。
来自临床的真实数据凸显出我们对肝癌早筛新技术、新方法的迫切需求。南方医科大学南方医院感染内科主任侯金林教授介绍说，据统计前来南方医院就诊的肝癌病人中，极早期和早期的病人仅占40%，这部分人的五年生存率能够接近或超过60%，而如果是晚期肝癌的患者，五年生存率则不到20%（图1）。
图1. 肝癌不同分期的5年生存率差异
为了突破现有肝癌早筛方案在效率和性能方面的瓶颈，在2018年，由国家肝癌科学中心/上海东方肝胆外科医院和广州南方医院及和瑞基因共同牵头联合全国近20家单位参与的全国多中心、前瞻性万人队列肝癌极早期预警标志物筛查项目——PreCar正式拉开帷幕。PreCar是国家“十三五”重大专项子项目，同时也是全球规模最大、进展最快的肝癌前瞻性队列研究，着力于外周血肝癌极早期预警标志物的筛选、鉴定及验证。“无限风光在险峰。”带着实现肝癌早诊早治的宏伟愿景和多年来深耕肿瘤基因检测领域的技术积累，和瑞基因与全国顶尖科研团队一道，踏入了理论探索与技术开发、优化和验证交汇融合的未知领域。
宝剑锋从磨砺出——依托前瞻性万人队列打造准确、可靠、有实际获益的肝癌早筛服务
突破与创新从来不是一蹴而就的。 在和瑞基因总经理周珺看来，实现有效的肝癌早筛需要四个 条件：一是需要构建一个可靠的底层通用实验技术平台，为临床研究打下坚实的基础；二是通过回顾性的研究去寻找与肿瘤的早筛早诊相关的生物标志物，构建出早筛早诊的产品模型；三是这个模型必须要经过大规模、前瞻性的队列验证，检验模型在真实的世界里的表现；最后是面向市场进行宣传与推广。 周珺认为，在整个过程中要“让数据说话”，用来自实验和临床中的真实数据来指导技术的开发和优化，而不是相反。这一理念也贯穿了“莱思宁”肝癌早筛服务研发的始终。
挑战伴随着探索的每一步。对于肝癌早期筛查来说，面临的第一个问题就是没有足够的先验知识，不像肿瘤中晚期的基因检测，有着丰富的研究结果和临床数据提供支撑。其次，在肿瘤发生的早期，血液中的各类肿瘤标志物含量极低，比如说在肿瘤长到1厘米大小的时候，血液中释放的肿瘤基因组所占的比例只有十万分之六，我们要把极微量的DNA片段捕捉到，准确地读取序列，还要有效地去除背景噪音，其难度不亚于大海捞针。最后，肿瘤发生、发展的机制极为复杂，不是搞清楚几个分子，几个通路就能解决问题，而是需要将复杂的基因组信息和临床信息进行联合分析，才有望实现更加准确的风险评估。
严峻的挑战中孕育着巨大的机遇。国内外肿瘤检测领域的顶尖科研机构和明星公司纷纷投入到早期筛查产品的研发工作中。依托着面向中国人群的前瞻性万人队列研究，和瑞基因在肝癌早筛领域无疑占据一定优势，他们将交出一份怎样的答卷？
首先面临的问题是技术路线的选择。和瑞基因团队对目前国内外已经开展或正在开展的肿瘤早筛项目进行了回顾性研究，发现不管是ctDNA、甲基化/羟甲基化还是蛋白标志物，单一靶标的预测性能是有天花板的，多数方法的灵敏度徘徊在80%左右甚至更低。经过大量的实验摸索，和瑞基因团队发现，只有对多个维度的信息进行综合分析，才能进一步突破灵敏度和特异性的上限，准确区分肝硬化和肝癌人群微弱的分子生物学差异，从而为肝癌超早期预警提供有效方案。
在实验技术层面 ，为了精准地获取肿瘤早期游离于血液中的ctDNA的多维度信息，我们需要一种既灵敏又可靠的检测技术，提高检出率，降低误诊和漏检。和瑞基因自主开发的cSMART2.0技术凭借其独有的单分子条码组（UMG）设计和极高的分子捕获效率，是开展肿瘤液体活检实现低频检测的优秀解决方案。该技术助力基因编辑脱靶位点检测和免疫治疗动态监测研究的相关文章多次发表于国外顶级期刊。借助cSMART2.0技术，和瑞基因“莱思宁”肝癌早筛服务在保持特异性93.1%的情况下，灵敏度达到95.7%以上。
在生物信息学层面 ，由于肝癌早期的分子特征非常复杂，没有现成的方案和标准可以借鉴，因此和瑞基因团队充分发挥大队列研究的数据资源优势开展无偏好的探索性研究，借助机器学习的方法寻找分类效能最优的特征组合，以此构建的分类器纳入了羟甲基化（5hmC）修饰、基因组点突变（SNV）、HPV基因组整合、拷贝数变异（CNV）等多维度信息，除此之外，和瑞基因还创造性地将核小体在DNA片段上的分布模式也纳入考量，形成了一套独创的跨平台多维度数据综合分析算法，并借助大样本的人群基线数据对分析方法进行了优化。接下来，通过独立的验证集（validation set）对阈值进行优化，进一步提升灵敏度和特异性，最后在独立的测试集（test set）中对分类性能进行了评估。结果显示，整合多种组学、多维度指标构建的分类器性能优良，回归分析验证其性能达到AUC=0.992（图2A），相比传统血清标志物和单组学指标有着极为明显的优势。
图2.多组学检测与传统血清学检测的AUC曲线
实践是检验一项技术最好的标准。周珺指出，回顾性研究固然很有价值，但要判断一个产品是不是真的符合临床标准，能不能满足临床需求，必须借助前瞻性队列在真实世界中看看它到底能不能帮助高危人群，能不能帮助临床医生更早、更好地找到极早期的患者。PreCar作为一项多中心、前瞻性万人队列肝癌极早期预警标志物筛查项目，正是最好的试金石。福建医科大学孟超肝胆医院肝内科副主任黄祖雄教授分享了一个代表性案例：一位57岁男性乙肝伴肝硬化，研究入组后，在历经18个月随访过程中，4次访视甲胎蛋白和B超均未显示有肝癌风险，但和瑞基因肝癌筛查基因检测判断为转癌高风险。随后在第四次访视中，该患者诊断为早期肝癌。随着PreCar项目不断推进，这样的例子不胜枚举。“多例案例证明cfDNA基因检测可以联合血清标志物、影像学，提前发现极早期微小肝癌，早预警、早诊断、早治疗，有效延长肝癌患者生存期。”黄祖雄教授说。
经过万人队列的验证，和瑞基因肝癌早筛服务“莱思宁”可以提前6-12个月，甚至更早发现极早期微小肝癌（图3）。在传统血清学筛查为阴性的肝癌患者中，cfDNA检测阳性率为54.5%，极大提升了筛查准确性，降低漏诊；cfDNA检测联合影像学，可辅助进行肝结节的良恶性判定，为临床提供有效的参考指标。除此之外，和瑞基因“莱思宁”肝癌早筛服务作为一种无创的检测手段，还可以为肝癌患者提供术后动态监测，辅助预防肝癌复发风险。
图3. 和瑞基因肝癌早筛可以做到极早期筛查，提升5年生存率
结 语
PreCar项目取得的进展与成果表明，利用ctDNA测序采集多组学数据，并借助机器学习方法联合影像、病理、蛋白等进行跨平台综合分析，可以大幅提高肝癌早期诊断的准确性，并将检测窗口提前到肝癌极早期。经过大队列验证的“莱思宁”肝癌早期筛查凭借其高灵敏度和高特异性，无疑有着良好的应用前景。与此同时，我们也清楚地知道，肝癌的早期筛查不仅仅是一个技术问题，甚至不仅仅是一个医学问题，它与公众意识、公共卫生成本、医学伦理等问题密切相关。和瑞基因总经理周珺认为，为谁做检测，在哪个阶段做检测，是我们需要审慎回答的问题。我们既要确保检测技术本身的准确性和有效性，又要考虑到检测是否能够给人带来实实在在的获益，而不是盲目地推广到所有健康人群。因此， 莱思宁自诞生之日起就立足于临床上早筛早诊的真实需求，致力于为肝癌高危人群（如病毒性肝炎、肝硬化患者）提供精准、及时的肝癌早期筛查和预警服务，实现临床上对高风险人群的分层管理。
问渠那得清如许，为有源头活水来。莱思宁的成功上市，背后是和瑞基因在底层通用技术平台建设方面的持续进步和创新。这个平台致力于将前沿的检测技术和生物信息技术及人工智能相结合，围绕数据的采集和挖掘形成闭环，不断孵化出针对各类肿瘤的检测产品，不断融合新的数据类型，搭建跨学科、多类别的早筛早诊平台。在这个过程中，技术的边界不断拓展，我们对于疾病的理解也将不断加深。在这个维度上，和瑞基因团队对肿瘤诊疗领域的探索和思考彰显出超出产品本身的价值。我们相信，迷雾终会散去，“一切肿瘤早诊早治，所有患者获得精准治疗”的美好愿景终将成为现实。