乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势，2015年女性乳腺癌新发病例约为2.32万，死亡病例约为4万，严重威胁着女性健康。现有的治疗手段主要为手术切除、术后辅以放化疗及内分泌疗法。术后患者定期复查、监测并及时调整治疗方案将有效改善预后。胸苷激酶1(thymidinekinase1，TK1)是一种与DNA合成及细胞增殖密切相关的关键酶，通过检测肿瘤细胞增殖速度，在乳腺癌中有较高表达，并能对乳腺癌患者预后进行有效评估。
医用三氧气体是由三个氧原子构成的强氧化活性气体，临床可被用于多种癌症术后的辅助治疗，因其刺激氧代谢，激活免疫系统，可能有效抑制肿瘤增殖，降低TK1水平。因此，本试验利用酶免疫点印记化学发光法检测三氧治疗乳腺癌患者术前、术后TK1水平变化，比较患者治疗前后肿瘤标志物CA15-3及CEA的变化，并与雌激素受体(estrogenreceptor，ER)、孕激素受体(progesteronereceptor，PR)等进行相关性分析，探讨TK1作为肿瘤细胞增殖标志物在三氧疗法对切除术后乳腺癌辅助诊断意义，并分析三氧疗法对于乳腺癌患者的疗效。
1资料与方法
1标本来源
收集2015年8月至2016年8月暨南大学医学院附属复大肿瘤医院女性乳腺癌患者血清标本104例，病理学检查证实均为乳腺浸润性导管癌。年龄39～66岁，中位年龄56岁;临床分期参照美国癌症联合委员会6(AmericanJointCom-mitteeonCancer，AJCC)乳腺癌TNM分期第7版:Ⅰ－Ⅲ期71例，Ⅳ期33例。所有患者行三氧治疗前均获手术切除，间隔时间平均为36个月。三氧治疗前、后三个月内均未接受放、化疗。同时收集健康体检者血标本100例作为对照，对照组与治疗组年龄、性别无统计学差异。上述标本收集均经本院医学伦理委员会审批并同意。
2方法
外周血标本采集
于清晨空腹抽取无抗凝静脉血3mL，以3000转/min离心8～10min分离血清，分装于两个离心管，待检。
TK1的检测
测定步骤:把不同浓度的校准品按顺序点样到模板的A1、A2及A3位置上，每孔3μL，待检血清按每孔3μL顺序点在膜上后面的其他位置，室温下自然晾干约30～60分钟至自然翘起。将膜放入反应盒内，用去离子水振摇洗膜2次，弃去洗液，加入配好的封闭液(3g封闭剂干粉加50mL稀释液)，25℃左右下振摇封闭30分钟。弃去封闭液，按1∶500稀释度加入抗TK1-IgY，25℃左右下振摇反应120分钟。洗涤3次。按1∶500稀释度加入生物素化IgY二抗，25℃左右下振摇反应40分钟，洗涤同上。按1∶1500的稀释度加入SA-HＲP，25℃左右下振摇反应60分钟，洗涤同上。将ECL1和ECL2等量混合后过膜浸湿，精确反应1分钟，放入压膜透明胶片内，挤干剩余溶液，放入化学发光分析仪内，计时5分钟，拍摄分析。产品说明书以0～2.0pmol/L为正常范围，TK1＞2.0pmol/L预示存在增殖性疾病风险。
肿瘤标志物的检测
采用化学发光法，实验步骤严格按照试剂盒操作说明书进行，CA15-3、CEA的正常范围分别为(0-25)U/mL、(0-4.7)ng/mL。
2实验结果
1.三氧治疗前乳腺癌患者与健康体检组TK1水平的比较
104例乳腺癌患者TK1值平均值(1.52±1.53)pmol/L，与健康体检组的(0.54±0.42)pmol/L相比，差异有统计学意义。
2.三氧治疗乳腺癌患者前后 TK1 水平的比较
三氧治疗乳腺癌患者前 TK1 值范围为 0.01 ～ 5.38pmol/L，平均值为( 1. 52 ±1. 53) pmol/L，与三氧治疗乳腺癌患者后 TK1 值比较，差异有统计学意义 。
3.乳腺癌患者不同临床分期三氧治疗前后 TK1 水平的比较
Ⅰ-Ⅲ期患者治疗前 TK1 平均值为( 1. 05 ± 1. 17)pmol/L，治疗后平均值为( 0. 38 ± 0. 44) pmol/L，差异有统计学意义( P ＜0. 05) ; Ⅳ期患者治疗前 TK1 平均值为( 2. 53 ±1. 73) pmol/L，治疗后平均值为( 1.47 ± 0. 94) pmol/L，差异无统计学意义。
4.不同临床分期乳腺癌患者三氧治疗前后肿瘤标志物的比较
Ⅰ-Ⅲ期切除术后乳腺癌患者三氧治疗前 CA15-3 阳性表达 9 例( 12.7%) ，CEA 阳性表达 10 例( 14. 1%) 。两者在三氧治疗前后比较，差异均无统计学意义( P ＞ 0.05) 。Ⅳ期患者三氧治疗前有 CA15-3 阳性表达 23 例( 69.7%) ，CEA 阳性 26 例( 78. 8%) ，两者在三氧治疗前后比较，差异均无统计学意义。
5.乳腺癌患者 TK1 水平与 EＲ、PＲ 的关系
104 例乳腺癌患者中有 86 例ER、PR 双阳性( n = 44) 和双阴性患者( n =42) 。通过对 ER(-)PR(-) 和ER(+) PR(+) 乳腺癌患者三氧治疗前 TK1 与ER、PR进行双向无序 Spearman 相关分析发现，TK1 与ER、PR间有关联 。
3结果讨论
1关于TK1
TK1作为合成DNA的嘧啶补救途径关键酶，与细胞的增殖密切相关，是异常增殖动力学标记物，肿瘤细胞TK1的表达明显高于正常组织，其在正常组织中几乎检测不出。这一新的细胞增殖标志物可用于健康体检、肿瘤筛查、疗效评价、监测和预后评估等并具有重要的临床价值。在利用TK1对乳腺癌进行鉴别诊治应用方面，有研究发现TK1表达在不同级别乳腺癌组织中存在差异，分级高者表达高，且TK1与Ki67表达有同一性。TK1在乳腺癌组织中高表达，对于导管原位癌的诊断具有较高的辅助价值。陈曲波等通过TK1对30例乳腺癌化疗疗效的应用价值进行了评估，其结果认为血清TK1水平可反映肿瘤细胞增殖，有望成为乳腺癌预后判断及病情监测的重要指标。
2三氧的抗癌机理
根据中华抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范中提出的乳腺癌治疗原则，当患者确诊为乳腺癌后，手术后辅以放化疗和/或内分泌治疗等是常规治疗手段。在术后无进展期或进展期，为尽可能地减少或延迟乳腺肿瘤再次复发或原处转移的发生，临床可考虑采用其它辅助疗法。由于三氧疗法一方面能提高红细胞的氧含量，加快再氧合速度，增加再氧合细胞比例，解决乏氧肿瘤细胞对放射线或化疗药物的抗拒，清除放化疗过程中形成的自由基，有助于身体的恢复。另一方面，三氧可刺激机体产生多种免疫活性因子，如各种内源性干扰素，白细胞介素，肿瘤坏死因子和转化生长因子等，能诱导长期的抗肿瘤免疫，抑制肿瘤细胞的分裂与增殖，直接杀伤肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞凋谢，抑制肿瘤血管生成。并且，国外有研究证实三氧可抑制体外乳腺癌细胞的增殖。因此，本研究特通过血清TK1水平对三氧疗法治疗乳腺癌的疗效进行评价。
3Ⅰ-Ⅲ期患者效果明显
在三氧治疗前，本研究将104例乳腺癌患者TK1水平与健康体检组进行了比较。结果发现差异有统计学意义(P＜0.05)，但总体乳腺癌患者TK1的平均值低于2pmol/L，处于正常围。究其原因可能是施行原发肿瘤切除术后，大部分患者处于无进展生存期阶段，体内无大量肿瘤细胞增殖有关。然而，总体TK1值仍远高于健康人水平，并趋向风险值，因此，此结果仍有一定提示价值。另外，Ⅳ期乳腺癌患者术后TK1值为(2.53±1.73)pmol/L，高于正常范围，提示存在增殖性疾病风险，与临床分期具有一致性。
这位国外的乳腺癌患者在经历过手术后，坚持做三氧大自血，一周做两次，到今年为止已有17个年头，虽然今年已经79岁了，但还保持着非常好的精神状态。
其次，本文分析了三氧治疗乳腺癌前后的TK1表达水平差异。结果发现:三氧治疗后乳腺癌患者TK1水平显著低于治疗前(P＜0.05)，提示三氧疗法能抑制TK1的增殖，可能使切除术后乳腺癌患者获益。根据临床分期进一步统计，Ⅰ-Ⅲ期患者经三氧治疗后TK1值显著低于治疗前(P＜0.05)，提示获益患者主要为Ⅰ-Ⅲ期患者，但Ⅳ期患者经治疗后TK1值与治疗前相比无统计学意义(P＞0.05)，表明Ⅳ期患者对三氧治疗无明显获益。
4三氧抑制肿瘤细胞增值
为体现该疗法对乳腺癌患者的治疗效果，本文同时对治疗前后肿瘤标志物进行了统计分析，结果发现Ⅰ-Ⅲ期切除术后乳腺癌患者CA15-3和CEA阳性表达率低且均值位于正常值范围，经三氧治疗后，CA15-3和CEA水平总体呈下降趋势，虽治疗前后差异无统计学意义，但与TK1结果具有一致性。Ⅳ期患者CA15-3、CEA阳性率较高，治疗后亦未见下降，提示三氧治疗对Ⅳ期患者治疗效果意义不大。但考虑在治疗过程中，CA15-3、CEA亦未见显著升高，结合TK1的检查结果，不排除三氧治疗控制乳腺癌肿瘤细胞增殖的作用。
已有研究表明，ER、PR为判断乳腺癌预后好的相关因素。TK1阳性(＞134Du/L)与ER、PR双阴性是乳腺癌患者术后复发的指标。本实验中发现TK1与ER、PR中度相关(r=0.455，P＜0.05)，与陈曲波等报道ER、PR双阴性乳腺癌患者TK1水平比ER、PR双阳性患者高的结果基本一致，说明TK1与ER、PR联合检测能更好的反映乳腺癌患者的预后及进行疗效评估。综上所述，通过对血清TK1值的测定，可以推测三氧疗法可能有效抑制Ⅰ-Ⅲ期切除术后乳腺癌患者肿瘤细胞增殖，控制疾病发展，然而，由于本次入组患者人数较少，有待进一步扩大研究人数验证结果。