来自美国威斯康辛医学院的Richard Aster教授荣获了2019的Wallace H. Coulter大奖，奖励其在血细胞，特别是在血小板免疫疾病方向的贡献。这是血液病学的终身成就奖，是每个血液学专家梦寐以求的奖项！

本文我们就一同了解一下此次的获奖报道，同时和大家分享Richard Aster团队的其他研究进展。

Richard Aster教授

Richard Aster，医学博士，因在血液学领域的终身成就而被授予2019年Wallace H. Coulter奖。他是威斯康星医学院医学和病理学系的教授，也是威斯康星血液中心的高级研究员。

他获得密歇根大学的本科和医学学位，之后在波士顿的马萨诸塞综合医院实习。他说：“我对科学有着浓厚的兴趣，希望能从事研究工作。在医学院，我和甲状腺疾病组一起工作，正考虑成为一名内分泌学家。”

但正如许多伟大科学家的职业生涯一样，阴差阳错的机会使其没有选择预期的工作，反而在其他领域大放异彩，这开始于他在NIH寻求住院医师的时候。他回忆说：“我了解到，在NIH任职期间，有机会从事研究培训。内分泌学没有空缺，但血液学有空缺，我接受了。“

Aster博士的临床研究兴趣集中在影响血细胞的免疫疾病上，特别是那些涉及血小板的疾病。他对这一领域的贡献很早就开始于他在波士顿市医院分析肝病患者脾脏和血液循环中血小板的分布。

1970年，他开始在密尔沃基的威斯康星东南部血液中心（现在是威斯康星的血液中心）工作，并在那里帮助将该中心发展成为一个全球模范性实验室和著名的研究机构。

他贡献了血小板特异性同种抗原系统35种已知成分中约三分之一的鉴定和特征化，从这项工作中获得的见解为新生儿同种免疫性血小板减少症、原发性免疫性血小板减少症和药物诱导免疫性血小板减少症的病理生物学研究提供了依据。

他的工作还包括391篇同行评议的文章，数百篇评论，以及现在临床标准的诊断技术的发展。2012年，他被授予Henry M. Stratton勋章。他与血液中心同事分享了这些成就，并承认他的工作只是其中的一部分。他说：“我们这些年来取得的进展在很大程度上是渐进的，希望所取得的研究成果最终能成为有用的东西。”

Aster博士目前的主要兴趣是肝素诱导的血小板减少性血栓形成和检测药物依赖性血小板反应性抗体的改进方法。当被问及他认为最有突破潜力的领域时，他谈到了科学进步的快速步伐。他说：“很难知道下一个突破会在哪里出现，”但他强调，单细胞PCR和RNA转录组的高通量测序对于提高血液学家对抗体介导的血液病的认识至关重要。

Piperacillin诱导免疫性血小板减少

β-内酰胺类抗生素（青霉素类、头孢菌素类等）对免疫性溶血性贫血、中性粒细胞减少症和药物诱导血小板减少症（DITP）有相对常见的触发作用，但对这种副作用的机制尚不清楚。

脲基青霉素，piperacillin，是一种β-内酰胺类药物，最常被认为是引发免疫性细胞减少的诱因。本文描述了18例piperacillin相关性血小板减少症患者的抗体药物依赖性反应。

18例患者中的每一例都有一个抗体，当存在可溶性piperacillin时，抗体与正常血小板反应强烈（流式细胞术），而与红细胞反应不明显。这些反应没有被反应混合物中能达到的最高药物浓度所抑制，在正常血清中也没有发现类似的抗体。

这些反应类似于在对奎宁、万古霉素和许多其他已知引起DITP的药物敏感的患者中发现的药物依赖性抗体（DDAbs）的反应。有证据表明，这种药物通过与抗体CDR3反应并改变其特异性来促进DDAbs与靶点的结合。

β-内酰胺类药物不同于大多数其他药物，它们能够自发地与膜蛋白上的游离氨基共价连接，从而产生潜在的免疫原性半抗原，这种半抗原可以诱导理论上能够导致piperacillin治疗患者血小板减少的抗体。

本研究优化了用piperacillin使血小板和红细胞“半抗原化”的条件，并测试了病人和正常人血清中识别piperacillin处理细胞的抗体。过量可溶性药物完全抑制结合是“阳性”反应的标准。

如下表所示，18名受试者和20名正常人血清中均发现与piperacillin包被红细胞反应的IgG和IgM抗体；几乎所有受试者和20名正常人血清中均发现与piperacillin包被血小板反应的IgM抗体，大约一半的受试者发现了类似的IgG抗体。IgM-抗体对piperacillin包被红细胞的反应强度与对piperacillin包被血小板的反应强度密切相关。

研究结果表明，在piperacillin诱导的血小板减少症患者中存在两种明显不同类型的piperacillin特异性抗体。第一种通常是IgG，仅在存在可溶性药物时与血小板而非红细胞结合，即使在高浓度下也不受过量药物的抑制，与piperacillin的接触和血小板减少症的发生有关，在正常人中没有发现。

这种行为类似于奎宁、万古霉素和许多其他药物诱导的DDAbs。第二种通常是IgM，较少是IgG，与piperacillin包裹的血小板和红细胞结合，被可溶性药物抑制，作为IgM亚型，几乎在所有正常人中都发现【1】。

HIT发病机制的意义

肝素诱导血小板减少症（HIT）是肝素治疗的一种严重不良反应，其特点是产生PF4/聚阴离子复合物抗体。然而，HIT抗体是异质的。

在固相酶联免疫分析（EIA）中，一些抗体与肝素/聚阴离子复合物结合，但不激活血小板；在血清素释放分析（SRA）和最近描述的PF4依赖性p-选择素表达分析（PEA）中，其他EIA阳性抗体也激活血小板。一般认为只有血小板活化抗体是致病的。

研究表明，血小板活化抗体，而不是那些只在EIA中呈阳性的抗体，能识别血小板结合的PF4。假设当致病性HIT抗体与血小板表面的靶点（可能是硫酸软骨素）结合时，其识别暴露在PF4上的表位，而当PF4与肝素或其他聚阴离子形成复合物时，血小板表面不产生该表位。

本文描述了利用新开发的单克隆抗体的研究，证明了这一概念的可行性，并提出具有这种特异性的HIT抗体在HIT发病机制中可能是重要的。

用PF4/肝素复合物免疫小鼠产生单克隆抗体。文中利用PF4/聚阴离子EIA和PEA对候选克隆采用了一种新的双重筛选策略。选择用于研究的单克隆抗体分别命名为431.3、431.4和447.1，并与KKO、一种广泛研究的类HIT单克隆抗体和一种同型对照（下图A）进行比较。

在EIA中，KKO强烈识别PF4/聚乙烯磺酸（PF4/PVS），但不单独识别PF4，并被大剂量肝素（100U/mL）抑制。单克隆抗体447.1具有与KKO相似的EIA曲线，但具有显著较低的光密度（0.56 vs. 2.43 OD），431.3给出的反应表明它仅识别PF4，但对PF4/PVS复合物（1.96OD）表现出更强的反应性。

然而，单抗431.4与同型对照相似，在EIA中完全不结合（下图A）。相反，所有4个单克隆抗体都能强烈识别经PF4处理的血小板（下图B）。此外，四种单抗在PEA中均产生强烈的阳性反应，其中单抗与PF4启动的血小板相互作用诱导p-选择素表达（下图C）。

EIA评估需要多个洗涤步骤，而评估与PF4处理血小板结合的IgG的研究只使用一次洗涤，而PEA是一种“不洗涤”分析。因此，在EIA中431.4的反应失败可以解释为单抗易被洗涤除去，可能是由于对其目标的亲和力较低。

因此，本文使用生物层干涉法（Octet系统，Pall ForteBio）实时研究了mAb与PF4/肝素复合物的结合。在这个系统中，单抗431.4和KKO产生一个稳定增加的信号，达到饱和，而431.4与PF4/肝素没有结合，与EIA结果一致（下图D）。

这些发现表明，mAb 431.4与血小板表面的PF4结合，并诱导血小板活化（通过p-选择素表达测定），但不能与肝素或PVS复合物中的PF4反应。这种行为与在两种分析中都有反应的“HIT样”单抗KKO的行为形成鲜明对比。

尽管HIT患者的抗体在血小板活化试验和EIA试验中经常出现阳性反应，但有明确的例子表明，抗体在一种试验中是阳性的，而在另一种试验中可能不是阳性的（例如EIA阳性，SRA阴性抗体在临床实践中很常见）。

因此，在HIT患者中，无疑存在具有不同特异性的多种抗体。越来越多数据表明，虽然EIA（光密度）反应强度通常与血小板活化抗体相关，但也有明显的例外（如单抗447.1）。

这些结果表明，需要根据特异性和反应强度来分离和鉴定人抗体，以确定像单抗431.4和447.1这样的抗体在多大程度上参与HIT的发病【2】。

PTP动物模型与临床表现

输血后紫癜（PTP）是一种少见但危及生命的疾病，其特点是输血后一周内发生严重血小板减少（TP）。PTP的特点是对输注的人血小板抗原（HPA）有特异性的IgG抗体，通常HPA-1a位于αIIb/β3整合素（GPIIb/IIIa）上。

人们普遍认为，在PTP中，尽管受体的血小板缺乏同种抗体特异的抗原，但同种抗体却以某种方式导致了血小板的破坏。

一些报道表明PTP的根本原因是血小板特异性自身抗体，这种抗体很难被检测出来，因为它在破坏自体血小板的过程中被吸收，并被伴随而来的非常有效的同种抗体所掩盖，但对这一概念的实验支持很少。

与HPAs相似的血小板同种抗原尚未在动物中定义。利用一个公共数据库，该研究鉴定了四个小鼠品系（C57BL/6J（C57）、129S1/Svlmj（129）、PWK/PhJ（PWK）和SPRET/EIJ），它们在GPIIb/IIIa细胞外区域的氨基酸残基上存在差异，可能包含潜在的同种抗原。

每周进行交叉品系血小板免疫（腹腔注射佐剂），持续5周，同时监测血小板计数和血小板相关IgG（PAIgG），并保存血浆样本用于血清学研究。经过2-4次免疫后，39个交叉株中的每一个诱导识别供体而非受体血小板的“同种抗体”（流式细胞术）。

血小板减少（＜最大血小板计数的50%）出现在不同血小板的28/39（71%）小鼠中，而在相同血小板的小鼠中未发现；其中12只（30%）形成了严重的TP（＜15%）。

识别同基因血小板的自身抗体在所有出现深度TP的动物中都得到了鉴定，其效力（通过流式细胞术测量）与TP的严重程度密切相关（p<0.001）（下图）。免疫沉淀显示同种抗体主要特异于供者血小板上的GPIIb/iia（N=13）和GPIb/IX（N=1）。

用两只免疫小鼠的脾细胞，分别在C57和PWK小鼠GPIIb的111（Gly）和37（Val）处，制备了两株针对单一多态性氨基酸的单克隆抗体（MBC417.1和MBC425.1）。

据悉，这些是小鼠体内第一种针对血小板膜糖蛋白单一氨基酸多态性的同种抗体，因此可与人类体内发现的HPA抗体相媲美。

研究结果定义了一个模型（PWK和129小鼠之间的血小板免疫），在该模型中，供体血小板上识别GPIIb/IIIa的常规同种抗体反应定期转变为能够导致严重血小板减少的自身免疫反应，从而模拟了人类患者PTP的过程，并支持PTP是一种自身免疫性疾病。

该模型的成功开发可能与使用最近开发的野生捕获PWK品系作为免疫伙伴之一有关。小鼠模型的固有效用有望促进进一步的工作，为人类输血后紫癜从异体免疫向自身免疫转变提供分子基础【3】。

β-内酰胺类抗生素致免疫性血小板减少症患者药物依赖性抗体的交叉反应

目前有50多种β-内酰胺（BL）抗生素被积极用于治疗各种细菌感染。BL抗生素是最常见的DDAbs药物之一，DDAbs可导致药物诱导的DITP。

大多数DDAbs对致敏药物具有高度特异性，但β-内酰胺类药物都有一个共同的核心结构，并且侧基之间有许多相似之处，添加这些侧基是为了增强效力和修改特异性，从而增加了特定于一种BL的DDAbs与另一种BL交叉反应的可能性。

本文研究了33例DITP由9种常用BL药物诱导的DDABs，以确定是否存在交叉反应模式可能影响BL诱导的DITP患者的替代抗生素的选择。

当患者血清中的免疫球蛋白（但非正常血清）与正常血小板（存在药物时）发生反应时，流式细胞仪分析显示DDAbs为“阳性”。33例患者中检测到的DDAbs对9种不同的BL药物具有特异性，根据结构相似性分为两组，“青霉素”（1组）和头孢菌素（2组）（下图）。

第1组19种DDAbs为阿莫西林（2）、哌替西林（4）和哌拉西林（13）。结构相似的氨苄西林和青霉素也用这些抗体进行了测试。

第2组14个DDAbs为头孢羟氨苄（1）、头孢吡肟（2）、头孢他啶（2）、头孢唑肟（1）、头孢曲松（7）和头孢氨苄（1）的。在这些DDAbs组中确定的交叉反应如下表1和表2所示。

在两个结构组的药物特异性DDAbs中观察到许多相当强的（S）交叉反应（下表1和表2）。特别值得注意的是19个1组DDAbs与氨苄西林（6）和青霉素（6）（下表1）的交叉反应，以及14个2组DDAbs与头孢吡肟（6）、头孢唑唑（6）和头孢曲松（3）（下表2）的交叉反应。

结果表明，β-内酰胺类抗生素诱导的血小板特异性DDAbs与奎宁、磺胺甲恶唑、万古霉素等药物诱导的DDAbs相比，通常发生更多交叉反应。对于由β-内酰胺抗生素引起的免疫性血小板减少症患者，应谨慎避免改用另一种β-内酰胺，或在必要时仔细监测血小板计数【4】。

小结

Aster教授从1962年就开始参加ASH会议了，那时候只有350名参会者。Aster教授是亲眼目睹ASH会议的不断壮大，发展成如今几万人的规模。在Aster教授的培养下，一代又一代的科研和医学人才辈出，桃李满天下。

Aster教授在免疫性血小板疾病上做出的贡献也使今年Wallace H. Coulter大奖实至名归，这些贡献对疾病治疗的标准是一次又一次的突破，也逐渐成为各个国家治疗的指南。

参考文献：

【1】Mark Rasmussen, Daniel W.Bougie, Gregory H. Denomme and Richard H. Aster. 1078 SerologicCharacterization of Antibodies in Patients Experiencing Piperacillin-InducedImmune Thrombocytopenia.

【2】Anand Padmanabhan, ShannonPechauer, Curtis Jones, Daniel Bougie, and Richard H. Aster. 1144 NewMonoclonal Antibodies Reveal Distinct Specificities for Platelet Factor 4 Boundto Heparin Vs. Platelets: Implications for HIT Pathogenesis.

【3】Daniel W. Bougie, JessicaSutton and Richard H. Aster. 2349 Cross-Strain Platelet Immunization inSelected Mouse Strains Recapitulates Clinical and Serologic Findings Typical ofPost-Transfusion Purpura (PTP).

【4】Matthew John Slaught, Daniel W.Bougie and Richard H. Aster. 2350 Cross-Reactivity of Drug-DependentAntibodies in Patients with Immune Thrombocytopenia Induced By Beta-LactamAntibiotics.