几乎所有的病原体均有DNA或RNA基因组，通过测序技术检测病原体基因组，可以为感染性疾病的病原学诊断提供帮助。宏基因组下一代测序（mNGS）技术以高通量测序为工具，可对临床感染患者样本中的全部核酸片段化进行测序，理论上能够“无偏倚”地检出全部潜在病原体，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫等，尤其适用于病原不明的疑难感染性疾病的诊断，对提高感染诊断效率和准确性有巨大的应用潜力。
随着mNGS技术平台的完善和临床研究的增多，mNGS为急危重症感染和罕见病原体感染的病原体检测等方面提供了一种新的方法和平台，在临床上的应用越来越广泛。mNGS技术分为湿实验和干实验，整体流程大致分为7个步骤：样本采集、样本前处理、核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析和报告解读。在湿实验流程中，高通量测序技术应用于临床病原感染诊断面临着四大技术挑战[1]：
图1.临床病原感染诊断面临的湿实验挑战。
挑战一：如何克服样本中宿主核酸和样本病理特性的影响？
mNGS可对患者样本中的微生物和宿主遗传物质（DNA和RNA）进行全面分析，但临床样本中微生物的含量和基因组相对于宿主细胞来说占比非常低，样本测序数据中宿主基因组信息占比高达90%~99%，将影响检测的灵敏度。此外，临床感染患者样本多为病理性样本，各个样本的核酸总量、基因组大小、核酸质量以及人源核酸占比存在显著多样性，也将影响检测的准确性。针对高宿主背景这一问题，在国内mNGS专家共识[2]中提出了相关指导：高宿主背景标本提取时可采用经过验证的方法去除宿主细胞或者核酸。
挑战二：如何真正实现对病原微生物无偏倚地检测？
由于细菌、真菌、病毒和寄生虫各种微生物特性不同，样本前处理和核酸提取的方法需要兼容不同微生物的特征。对于提取比较难破壁的细菌和真菌核酸时，增加玻璃珠可以提高该部分微生物的提取效率，但是有可能会损失部分信息。
挑战三：如何针对不同种类的临床样本进行前处理？
病原微生物检测的样本类型主要有血液、痰液、肺泡灌洗液、脓液、脑脊液、新鲜组织等，这些样本的前处理均不一样，如痰液液化、组织研磨等。样本的稳定性是mNGS测序的一个重要考虑因素，样本处理前应尽量减少核酸降解的可能性。虽然通常mNGS对样本来源和核酸量方面的要求比较灵活，但不同的样本处理后对于后端的提取试剂盒兼容性的要求比较高。
挑战四：如何克服检测背景的干扰？
目前mNGS技术检测流程中用到的试剂中包含常见的环境微生物，例如核酸提取试剂盒、文库构建试剂盒，这些微生物统称为“试剂背景菌”。据Salter S J[3]等研究发现，随着模拟样本（投入定量肠道沙门菌）稀释倍数增加，肠道沙门菌特异性序列占比逐步降低，其他微生物序列（试剂盒基因组）逐步占比提高。尽可能减少环境以及试剂盒来源背景菌的存在和干扰，是mNGS技术面临的一大挑战。
图2.不同提取试剂盒提取后背景菌的占比情况。 [3]
诺唯赞作为高通量测序建库试剂领域的领军企业之一，自2014年开始专注于高通量测序试剂的研发。2018年，诺唯赞开始与病原微生物检测行业的企业密切合作，为各大企业提供大量用于病原微生物检测的试剂材料。秉承“立足于专业能力和不懈创新，通过优质的产品和服务，持续为客户创造价值，成为生物科技领域的领导者”的企业愿景，诺唯赞从湿实验端的提取以及文库构建两大领域入手不断打磨产品，并于近期推出了去宿主DNA提取试剂Vazyme #DC501以及低背景菌文库构建试剂盒，为各大病原微生物检测客户提供低背景菌的试剂材料，助力mNGS结果的客观判读。
据悉，诺唯赞推出的去宿主DNA提取试剂盒，可在高效清除宿主DNA同时，高效提取细菌、真菌、病毒等微生物DNA，将微生物“一网打尽”，快速提取微生物核酸，提高微生物检出效果。
图3. FastPure Host Removal and Microbiome DNA Isolation Kit实验原理。
公司团队以1 ml新鲜肺泡灌洗液、液化痰液、口腔拭子为样本，参照Vazyme #DC501的实验流程进行宿主清除及微生物DNA提取，对照组进行宿主不清除及微生物DNA提取，利用测序数据分析宿主清除前后宿主序列占比变化。
图4. Vazyme #DC501 宿主核酸清除前后的序列占比。
此外，诺唯赞去宿主及微生物总DNA提取试剂盒还具有高效的破壁功能。利用商业化标准品进行平行测试，发现该试剂盒对细菌、真菌核酸提取效率和市面同类产品相当。
图5.提取产物中微生物相对丰度检测结果比对。
试剂背景菌控制
mNGS湿实验端除了需要考虑病原微生物的提取效率之外，提取和建库过程中引入的背景菌也是mNGS在临床应用推进上不容忽视的问题。为了解决背景菌的问题，诺唯赞对相关试剂建立了一系列评价标准。对原料入厂检、生产过程中的控制以及出厂的背景菌检测等各环节的背景菌实行严格防控措施，确保为客户提供更高品质的试剂材料，提高客户在mNGS检测领域的竞争力，帮助mNGS检测行业的标准提升。