原标题:2018年8月CRISPR/Cas最新研究进展
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基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
即将过去的8月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。
1.Cell子刊：我国科学家成功利用碱基编辑修复人胚胎中的致病性基因突变
doi:10.1016/j.ymthe.2018.08.007
在一项新的研究中，来自中国广州医科大学附属第三医院、中科院生物化学与细胞生物学研究所和上海科技大学的研究人员利用一种改进形式的CRISPR基因编辑技术来修复活的人胚胎中的遗传缺陷。在近期发表Molecular Therapy期刊上的标题为“Correction of the Marfan Syndrome Pathogenic FBN1 Mutation by Base Editing in Human Cells and Heterozygous Embryos”的论文中，他们描述了他们的研究工作和他们取得的进展。论文通信作者为广州医科大学附属第三医院生殖医学中心的刘见桥（Jianqiao Liu）教授和中科院 生物化学与细胞生物学研究所的黄行许（Xingxu Huang）教授。
图片来自Molecular Therapy, doi:10.1016/j.ymthe.2018.08.007。
仅在三年前，一个中国研究团队首次利用CRISPR对人胚胎进行编辑。该团队试图利用这项技术修复人胚胎中的遗传缺陷。虽然这在当时成为世界各地的头条新闻，但是它的成功率很低---在经过这种技术编辑后存活下来的54个胚胎中，仅4个胚胎携带着成功得到修复的基 因。从那时起，人们就开发出一种新的被称作碱基编辑的CRISPR变体，它以更有效的方式发挥作用。这种新方法不会切断DNA链和利用携带着所需特征的DNA片段替换移除的DNA片段，而是仅仅改变DNA碱基---比如利用碱基G替换碱基A。在这项新的研究中，这些研究人员使 用这种新方法来校正导致人类患有马凡综合症（Marfan syndrome）的基因突变，在这种疾病中，患者在FBN1基因上发生G→A突变。这是一种导致结缔组织问题的疾病，而且给那些出生时就携带这种突变的人带来无数的问题。
这些研究人员报道他们对18个胚胎进行了基因编辑，并且在所有的这些胚胎中，事先设计好的碱基变换按照计划发生。但是，在两个胚胎中，其他的碱基也在无意中发生变换。他们声称他们的研究为这种碱基编辑技术提供概念验证---在现实世界的体外受精诊所中，有缺 陷的胚胎经发现后会被丢弃。然而，他们确实承认这个领域仍然是非常新的，而且在尝试将这种技术用于允许发育成胎儿的胚胎中之前，还需开展更多的研究工作。
2.Anal Chem：开发出高通量荧光测试方法来筛选CRISPR/Cas9抑制剂
doi:10.1021/acs.analchem.8b01155
CRISPR/Cas9基因编辑技术可能有朝一日治疗目前被认为是无法治愈的疾病。负责切除致病性的DNA片段的Cas9蛋白长期留在体内是不安全的。这就是为什么科学家们正在寻找方法来缩短这种蛋白在消除它的靶标后停留在体内的时间。为了这个目的，在一项新的研究中， 来自美国桑迪亚国家实验室的研究人员开发出首个同类型的测试方法，它能够廉价地快速准确地筛选数千种分子是否能够有效地关闭这种DNA切割蛋白。相关研究结果近期发表在Analytical Chemistry期刊上，论文标题为“Versatile High-Throughput Fluorescence Assay for Monitoring Cas9 Activity”。
Cas9在切割它的靶标后在体内停留的时间越长，就越有可能找到并切割不应被切割的类似DNA片段，这可能导致疾病。找到在Cas9完成它的预定任务后能够关闭它的化学物的第一步是开发发现这些化学物的工具。桑迪亚国家实验室生物化学家Kyle Seamon解释道，他们开 发出的这种测试方法将两种化学物放在一个DNA片段的两条相反的链上。在一条DNA链上，这种测试方法添加一个发出光线的荧光团（第一种化学物），而在另一条DNA链上，它添加一个吸收这个荧光团发出的光线的猝灭剂（第二种化学物）。
接下来，这种测试方法添加了一种潜在的Cas9抑制剂。如果这种抑制剂不起作用，那么Cas9将切割这个DNA片段，将这个荧光团与这个猝灭剂分离开来，从而使得这种测试方法在30分钟内发出明亮的光线。如果这种抑制剂有效地发挥作用，那么这种测试方法将不会发光。 不过在这种测试方法能够给出这种最终结果之前，这些研究人员必须添加一种能够导致Cas9从DNA上释放下来的化学物。Seamon说，“Cas9与DNA之间结合得非常紧密，即便DNA已被切割，它也会将切割后的DNA保持在一起。它不会放手。”
由于这个原因，很少有人开发出Cas9测试方法来测试DNA切割，而且也已存在的测试方法并不能够用于高通量应用中。这种新的测试方法一次可筛选一到两种化学物。通过这种方法，这些研究人员迄今为止已能够筛选将近20万种化学物抑制Cas9的能力，并鉴定出6种具有 抑制效果的化学物。
3.Genome Biol：利用CRISPR-SKIP跳过基因中的特定外显子，有望治疗多种遗传疾病
doi:10.1186/s13059-018-1482-5
在一项新的研究中，来自美国伊利诺伊大学的研究人员对CRISPR基因编辑技术进行改进，使得当将细胞中的一个基因转录为用于蛋白制造的RNA模板时，细胞中的转录复合物能够跳过这个基因的部分区域。这种被称作CRISPR-SKIP的新技术不会导致DNA链断裂，相反仅改变 靶DNA序列中的单个位点。这不仅给人们提供一种方法来清除发生突变的基因序列，而且也给人们提供一种方法来影响基因表达和调节。这种靶向编辑可能有朝一日用于治疗基因组突变引发的遗传疾病，比如杜兴氏肌肉萎缩症、亨廷顿舞蹈病或一些癌症。相关研究结果于 2018年8月15日发表在Genome Biology期刊上，论文标题为“CRISPR-SKIP: programmable gene splicing with single base editors”。论文通信作者为伊利诺伊大学物理学教授Jun Song和伊利诺伊大学生物工程教授Pablo Perez-Pinera。
图片来自Genome Biology, doi:10.1186/s13059-018-1482-5。
CRISPR-SKIP改变一个外显子起始处之前的单个碱基，从而导致细胞将这个外显子作为一个非编码区加以读取。当细胞将这个外显子作为一个非编码DNA片段时，它就不会出现在成熟的RNA中，因而有效地移除蛋白中它所编码的氨基酸片段。尽管跳过一个外显子导致蛋白缺 失一些氨基酸，但是由此产生的截短蛋白经常保持部分或全部活性，这可能足以恢复一些遗传疾病中的功能。
这些研究人员在来自小鼠和人类的三种不同的细胞系（包括健康的细胞系和癌细胞系）中测试了CRISPR-SKIP技术，结果证实它能够用于不同类型的细胞中。他们对接受CRISPR-SKIP处理的细胞中的DNA和RNA进行测序，发现CRISPR-SKIP系统能够高效地靶向特定碱基和跳过 一个外显子，并且还证实如果需要的话，能够将靶向不同位点的CRISPR-SKIP组合在一起跳过一个基因中的多个外显子。他们希望在活的动物体内测试这种技术的编辑效率，这是评估它的治疗潜力的第一步。比如，在杜兴氏肌肉萎缩症中，仅校正5%～10%的细胞就足以实 现治疗的益处。利用CRISPR-SKIP，这些研究人员在他们研究过的很多细胞系中观察到校正率达到20%～30%以上。
4.Metab Eng：开发出基于CRISPR/Cas9的CasPER，高效地对酶进行基因改造
doi:10.1016/j.ymben.2018.07.001
在一项新的研究中，来自丹麦技术大学、美国劳伦斯伯克利国家实验室、加州大学伯克利分校和中国科学院深圳先进技术研究院的研究人员开发出一种基于CRISPR/Cas9的方法，从而能够灵活地对必需的酶和非必需的酶进行基因改造。这有很多应用，包括开发产生基于生 物的药物、食品添加剂、燃料和化妆品的方法。相关研究结果发表在2018年7月的Metabolic Engineering期刊上，论文标题为“CasPER, a method for directed evolution in genomic contexts using mutagenesis and CRISPR/Cas9”。
这种新开发的方法称为CasPER，并且是基于CRISPR/Cas9等现有技术构建出来的，其中，CRISPR/Cas9近年来已用于酵母中的基因组改造和重编程。然而，这种新的工具能够让科学家们通过整合更长的多样化片段来对酶或它们的活性结构域进行基因改造，从而提供了靶向 特定基因组区域中的每个碱基的机会。在酵母中，CasPER能够以几乎100％的效率整合发生突变的DNA片段，甚至能够以多重的方式进行整合。
5.利用CRISPR/Cas9成功地修复人胚胎中的基因突变？多篇Nature论文针锋相对
doi:10.1038/nature23305; doi:10.1038/s41586-018-0381-y; doi:10.1038/s41586-018-0380-z; doi:10.1038/s41586-018-0379-5
去年，美国俄勒冈健康与科学大学的Shoukhrat Mitalipov及其团队在Nature期刊上发表一篇论文[1]，声称已通过基因手段对胚胎中的基因突变进行修复，如今在Nature期刊上又发表一篇论文[2]，为这种成功修复提供更多的证据。与此同时，另外两个研究团队在同一期 刊上发表论文对这种新证据提出质疑。
去年，Mitalipov团队在一篇论文[1]中概述了他们利用CRISPR/Cas9对人胚胎基因组进行编辑的实验结果，这种基因编辑的目的是对已知导致心脏病的一种基因突变进行校正。在这篇论文中，Mitalipov团队成功地切割DNA（来自亲本DNA）中的缺陷部分，但是不能够利用 一条非缺陷的DNA链加以替换。但是，他们进一步报道鉴于胚胎使用来自母本DNA的一条非缺陷的DNA链，因此无论如何，这条缺陷的DNA链已被正确地修复。
图片来自Nature, 09 August 2018, 560:E5–E7, doi:s41586-018-0379-5。
在这篇论文发表后，基因编辑研究界的许多其他人针对该论文发表了批评意见，指出Mitalipov团队在观察这种修复是否按照声称中的那样加以实现的测试中犯了错误。他们进一步表示该团队也可能误解了他们自己的发现：他们仅是注意到没有缺陷的存在，而不是得到修 复的基因组的存在。
如今，Mitalipov团队又发表了一篇论文[2]，声称他们开展的进一步研究表明他们原来的实验结果是正确的。但是这个领域的其他人仍然未被说服。一个研究团队在同期Nature期刊上发表了一篇论文[3]，概述了他们尝试对小鼠开展相同实验的经历。他们声称胚胎基因组 中发生了大量不想要的DNA片段缺失。另一个研究团队在他们的论文[4]中指出，Mitalipov团队使用的技术无法发挥作用，这是因为胚胎中的父本和母本DNA在早期发育过程中是物理分离的---基于这一点，胚胎无法利用母本DNA对经过CRISPR切割的DNA片段进行修复。其他 人也注意到没有办法确定Mitalipov团队使用的这种技术是否进行了其他的无法观察到的DNA切割，若有的话，这可能会导致其他的先天缺陷。
6.Science：利用CRISPR构建出的突变条形码记录每个细胞的发育历史
doi:10.1126/science.aat9804
所有人的生命都起源自单个细胞（即受精卵），这个细胞重复地进行分裂，从而产生两个细胞，然后是四个细胞，然后是八个细胞，一直到组成新生儿的大约260亿个细胞。发育生物学的一大挑战是追踪这260亿个细胞是如何和何时从一个受精卵中产生的。迄今为止，这 个领域到只能捕获和分析这个发育过程的快照。
如今，在一项新的研究中，来自美国哈佛大学怀斯生物启发工程研究所、哈佛医学院、加州大学圣地亚哥分校和伊朗谢里夫理工大学的研究人员开发出的一种新方法最终有可能让这项艰巨的任务得以实现。这种方法利用不断变化的遗传条形码（genetic barcode）积极地 记录发育中小鼠的细胞分裂过程，从能够将小鼠体内的每个细胞谱系追溯到它的单细胞起源。相关研究结果于2018年8月9日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR”。论文通信作者为哈佛大学怀斯生物启 发工程研究所和哈佛医学院的George Church博士和Reza Kalhor博士。
这些遗传条形码是利用特殊类型的DNA序列创建出来的，该序列编码一种称为归巢向导RNA（hgRNA）的修饰RNA分子，这种方法是由Church团队在2016年底开发出来的，发表在Nature Methods期刊上，标题为“Rapidly evolving homing CRISPR barcodes”。当酶Cas9存在 时，所设计出的hgRNA分子引导Cas9到基因组中存在的hgRNA序列上，随后Cas9在此处进行切割。当细胞修复这种DNA切割时，它能够在hgRNA序列中引入基因突变，随着时间的推移，这些突变足以产生独特的条形码。
这些研究人员首先培育出一种“创始小鼠（founder mouse）”，这种创始小鼠的基因组中散布着60个不同的hgRNA序列。他们随后让这种创始小鼠与表达Cas9蛋白的小鼠进行杂交，从而产生在受精后不久这些hgRNA序列就被切割并发生突变的受精卵。
每个hgRNA能够产生数百个突变等位基因；总的来说，它们能够产生独特的条形码，所产生的条形码包含着成年小鼠体内大约100亿个细胞中的每个细胞的完整发育谱系。
7.Nature：对人胚胎进行CRISPR/Cas9基因编辑会导致大片段DNA缺失
doi:10.1038/s41586-018-0380-z
在一项新的研究中，来自澳大利亚阿德莱德大学、南澳大利亚健康与医学研究所、拉筹伯大学、新加坡-麻省理工技术研究联盟和美国天普大学的研究人员发现了实现胚胎基因编辑潜在益处的一个重大障碍。相关研究结果发表在2018年8月9日的Nature期刊上，论文标题为 “Large deletions induced by Cas9 cleavage”。论文通信作者为阿德莱德大学的Paul Thomas教授。
这些研究人员对去年发表的一项似乎证实对人类胚胎进行基因编辑可高度有效地修复大多数胚胎中的一个缺陷基因的北美研究（Nature, 24 Aug 2017, doi:10.1038/nature23305）进行了调查。
Thomas说，他们的研究为那项北美研究中实现的基因校正提供了另一种解释：这种基因编辑技术并没有修复小错误，而是产生了更大的错误。
8.Mol Cell：新研究让CRISPR基因编辑更加安全和更加精确
doi:10.1016/j.molcel.2018.06.043
近年来最重要的科学进步包括利用一种快速的负担得起的CRISPR技术发现和开发对生物进行基因改造的新方法。如今，在一项新的研究中，来自美国德克萨斯大学奥斯汀分校的研究人员表示他们对这种技术进行简单地改进，这将导致它更准确地和更安全地进行基因编辑 ，从而为足以安全地在人体中进行基因编辑打开大门。
这些研究人员发现确凿的证据表明作为当前用于CRISPR基因编辑的最受欢迎的酶，也是第一个被发现的CRISPR蛋白，Cas9在基因编辑效率和精确度上低于一种较少使用的被称作Cas12a（之前被称作Cpf1）的CRISPR蛋白。相关研究结果于2018年8月2日在线发表在Molecular Cell期刊上，论文标题为“Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a”。
图片来自T. Yamano and H. Nishimasu。
鉴于Cas9更有可能在植物或动物基因组的错误位点上进行编辑，从而破坏健康的功能，这些研究人员认为切换到Cas12a将导致更安全的更有效的基因编辑。
在Rick Russell教授和研究生Isabel Strohkendl的领导下，这些研究人员发现Cas12a更加挑剔，这是因为它像魔术贴（Velcro）那样结合到基因组靶位点上，而Cas9更像是强力胶（super glue）那样结合到它的靶位点上。对这两种酶而言，它们中的每一种酶都携带着一 小段RNA（即向导RNA, gRNA），其中gRNA与靶DNA片段相匹配。当接触到某种DNA片段时，每一种酶都开始尝试着通过形成碱基对来结合到这种DNA片段上---从它的一端开始并沿着它前进，并进行测试以便观察DNA上的每个碱基与gRNA的匹配程度。
对Cas9而言，每个碱基对紧紧地结合在一起，就像少量的强力胶一样。如果gRNA和DNA的前几个碱基匹配良好，那么Cas9已与DNA紧密地结合在一起。换句话说，Cas9会关注基因组靶标中的前七个或八个碱基，但随着这个匹配过程继续进行，它就不那么注意后面碱基的匹 配性，这意味着它很容易忽略这个匹配过程后面发生的不匹配，这会导致它在基因组的错误位点上进行编辑。
对Cas12a而言，它更像是一个魔术贴扣带。在沿着DNA前进的每个位点上，它与DNA位点之间的结合相对较弱。为了让gRNA和DNA足够长时间地结合在一起而进行基因编辑，这就需要这两者在整个过程中都存在很好的匹配。这使得它更可能仅对基因组中的预期部分进行编辑。
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