原标题:人参皂苷Rh2对白血病有作用吗？

《人参皂苷Rh2 对白血病HL- 60 细胞凋亡的诱导作用》

李罗丝1，罗志勇2，文斌2，刘水平2，张阳德1

（1 .中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心，湖南长沙41 0008；

2.中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心，湖南长沙41 0078）

摘要：目的探讨人参皂苷Rh2 对人白血病HL- 60 细胞增殖和凋亡的影响。方法应用MTT 法检测人参皂苷Rh2 对HL- 60 细胞增殖的影响，采用DNA 的片段化实验，观察人参皂苷Rh2 对HL- 60 细胞凋亡的影响。结果G- Rh2 能明显抑制HL- 60 细胞增殖，呈浓度依赖性关系；人参皂苷Rh2 能明显诱导HL- 60 细胞凋亡，呈浓度和时间依赖效应，DNA 的琼脂糖凝胶电泳分析可见凋亡特征性的DNA 梯状图谱。结论G- Rh2 主要通过有效抑制HL- 60 细胞增殖并诱导其凋亡从而发挥其抗白血病效应。

关键词： 人参皂苷Rh2；HL- 60 细胞；增殖；细胞凋亡

中图分类号： R557 文献标识码： A

药用植物人参Panax ginseng C. A. Meyer 根为传统名贵中药材，其主要药用有效成分—人参皂苷（ginsenoside）系异戊二烯单元（五碳）构成的四环三萜达玛烷类化合物，由人参二醇和人参三醇皂苷组成。迄今为止，确定了结构的皂苷成分有30 余种，各皂苷单体均具有其独特的药理作用，临床应用十分广泛[1]。尤其值得关注的是，近年来国内外学者对人参皂苷Rh2[1~7]的抗肿瘤药理学研究日趋活跃和深入。研究表明，人参皂苷Rh2 （ginsenoside Rh2,G- Rh2）对肺癌[2]、肝癌[3]、神经细胞和胶质瘤[4]、乳腺癌[5]、前列腺癌[6]等多数肿瘤组织细胞，在抑制肿瘤细胞增殖，诱导分化和/ 或凋亡[1~7]方面均表现出明显的药理活性。本研究探讨了G- Rh2 对人早幼粒白血病HL- 60 细胞凋亡的诱导作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

人急性早幼粒白血病HL- 60 细胞系由本室保存；20（S）人参皂苷Rh2 购自吉林大学化学系，高效液相色谱鉴定纯度为98.7% ；MTT 【3- （4，5-dimethylthiazol- 2- yl）- 2，5- diphenyl tetrasodium bromide】、DMSO （Dimethyl sulfoxide）、蛋白酶K及RNaseA 购自Sigma 公司；RPMI 1640 培养基购自Hyclone 公司；小牛血清购自中南大学细胞生物学实验室；琼脂糖购自Takara 公司。

1.2 人参皂苷Rh2 对HL- 60 细胞增殖的影响

人白血病HL- 60 细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640 培养基中，37℃，5%CO2 条件下悬浮培养。取对数生长期HL- 60 细胞2×104/mL 的单细胞悬液以每孔200μL 体积接种96 孔板，加入人参皂苷Rh2（0~60μmol/L，溶解参皂苷Rh2 的DMSO终浓度<0.1%）处理HL- 60 细胞；在37℃和5%CO2及饱和湿度下，培养24、48 和72 h；每孔加入MTT溶液（5 g/L 20μL，37℃继续孵育4 h，终止培养；离心（200 g，5 min），然后弃去孔内培养液，每孔加入200μL DMSO，振荡10 min；在酶联免疫检测仪上测定570nm 波长各孔吸光度；计算细胞存活率。细胞存活率= （实验组的平均OD 值/ 对照组的平均OD 值）×100%，根据细胞存活曲线计算人参皂苷Rh2 抑制HL- 60 细胞增殖的IC50 或IC75 值。

1.3 人参皂苷Rh2 对HL- 60 细胞凋亡的影响

采用DNA 的片段化实验检测细胞凋亡[8]。以2×105/mL 接种HL- 60 细胞于培养瓶，分别采用0、5、10、25、34 和40μmol/L 的人参皂苷Rh2 处理HL- 60 细胞6 h，采用25μmol/L（IC50）的人参皂苷Rh2 分别处理HL- 60 细胞0、12 、24 和48 h；分别收集细胞，计数，并取等量的细胞PBS 洗1 次，1600g离心5min，去上清；细胞沉淀按每106 个细胞加入细胞裂解液（1%NP- 40，20 mmol/L EDTA，50 mmol/LTris- HCl，pH7.5）100μL 的比例裂解10 s，收集上

清用等量的细胞裂解液重复处理1 次；上清加入终浓度1%SDS 和终浓度5 g/L RNase A，56℃温浴2h；加入终浓度2.5 g/L 蛋白酶K，37℃温浴过夜；加入1/2 倍体积的10 mol/L 醋酸铵和2.5 倍体积的无水乙醇沉淀DNA，离心，去上清，75%乙醇洗涤DNA沉淀，再次离心，去上清；20μL TE （10 mmol/LTris- HCl，1 mmol/L EDTANa2，pH8.0） 溶解DNA 沉淀；取10μL 样品于2%琼脂糖凝胶TBE 缓冲液中50 V 电泳2 h；溴乙锭染色，凝胶成像仪下观察DNA条带并保存。

2 结果

2.1 人参皂苷Rh2 能明显地抑制HL- 60 细胞增殖

MTT 结果显示，0～60μmol/L 的G- Rh2 分别处理HL- 60 细胞24、48 和72 h 后，人参皂苷Rh2 能明显抑制HL- 60 细胞增殖，呈浓度依赖性关系；人参皂苷Rh2 作用HL- 60 细胞48 h 的半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）为25μmol/L，见图1。

2.2 人参皂苷Rh2 对HL- 60 细胞凋亡的影响

DNA 片段化实验显示，人参皂苷Rh2 能明显诱导HL- 60 细胞凋亡，呈浓度和时间依赖效应，且25μmol/L G- Rh2 作用HL- 60 细胞48 h 后，可见明显的凋亡特征性的DNA 梯状图谱（DNA ladder），34μmol/L G- Rh2 处理HL- 60 细胞6h 就明显可见DNA 梯状图谱，见图2。

3 讨论

肿瘤是一种体细胞无限制性地克隆扩增所致的疾病。肿瘤的产生和发展是一个逐渐演化的过程，并且在演化的过程中获得无休止的遗传和表观遗传改变，最终导致肿瘤的异质性和多样性。尽管如此，不同的肿瘤仍存在共同的特征- 失控的细胞增殖与凋亡的受抑，亦是肿瘤形成的核心要素。因此，寻找能够抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的药物将成为肿瘤治疗干预的切入点[1]。有鉴于此，本研究探讨了人参皂苷Rh2 对人白血病HL- 60 细胞增殖与凋亡的影响。结果表明，G- Rh2 能有效抑制HL- 60 细胞增殖，且抑制效应呈浓度依赖性关系，见图1，半数抑制浓度IC50 为25μmol/L；DNA 片段化实验显示，人参皂苷Rh2 能明显诱导HL- 60 细胞凋亡，呈浓度和时间依赖效应，且25μmol/L G- Rh2 作用HL-60细胞48 h 后，可见明显的凋亡特征性的DNA 梯状图谱（DNA ladder），34μmol/L G- Rh2 处理HL- 60细胞6h 就明显可见DNA 梯状图谱，见图2。此外，Kim 报道G- Rh2 能诱导HL- 60 细胞向成熟的粒细胞分化[7]。因而，G- Rh2 诱导HL- 60 细胞凋亡与分化的关系及其分子机制仍值得进一步探讨。本研究结果表明，G- Rh2 能有效的抑制HL- 60 细胞增殖，并诱导HL- 60 细胞凋亡，这为下一步深入阐明G- Rh2抗白血病分子调控机制提供了重要实验依据。