非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种越来越常见的进展性疾病，目前全世界约有25%的成年人受到影响。NAFLD分为单纯性脂肪变性非酒精性脂肪肝（NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。NASH可能发生纤维化，并可能最终发展为终末期严重肝病。NAFL通常被认为缺乏进展能力。但最近研究数据表明，NAFL也可能转化为NASH，进而发展为晚期纤维化。
为充分了解NAFLD演变过程中复杂转录组变化情况，英国纽卡斯尔大学研究团队利用健康肝脏对照和NASH相关肝硬化患者的全组织学谱进行了全面的转录组分析。研究人员采用整合转录组学的方法解开了NAFLD逐步进展的途径，确定并验证了与疾病早期阶段、后续进展和特定组织学特征相关的基因表达特征。相关成果已于近日发表在Sci Transl Med上。
文章发表在Sci Transl Med上
对NAFLD患者进行分层及NAFL中的转录变化
该研究纳入了403名个体、381例NAFLD样本和22例对照样本的转录组数据，覆盖了从正常肝组织到NASH-肝硬化的全部组织学阶段范围。最终共有206份来自NAFLD患者的样本被纳入发现队列，进行高通量RNA序列分析。研究团队基于基因表达的无监督聚类将发现队列中的206个NAFLD样本分为两个不同的集群：A簇和B簇。在两簇之间，研究发现了1292个差异表达的基因（DEGs）。KEGG途径分析表明，与细胞外基质相互作用、局灶性粘附、PI3K-Akt信号和Wnt信号相关的基因丰富富集。
基于纤维化阶段、疾病活动指数和PNPLA3 rs738409变体的携带情况，研究团队将NAFLD患者样本进行了分层，并基于转录信息定义了一个显示高Wnt信号、活跃组织重构和祖细胞介导再生的患者亚组，发现NAFLD是一种比以前临床上定义的更加异质的疾病。
图1. NAFLD患者使用RNA-seq的无监督聚类。来源：Sci Transl Med
为进一步了解NAFLD的发病机制和进展，研究团队比较了NAFLD的不同阶段与对照样本的RNA-seq数据集。在NAFLD和对照样本之间，以及在1875和3578 DEGs之间，通过比较各个阶段，共鉴定出2603个DEGs。同时，研究发现一些基因在早期疾病（NAFL）中的表达增加，包括细胞衰老标记物CDKN1A/p21、炎症标记物IKBKG/NEMO等，其表达随着NASH的发展而升高，但随着纤维化的进展而减弱。表明与炎症、细胞衰老等相关的转录组变化在NAFL开始后不久以及组织学上呈现明显的脂肪性肝炎之前就开始发生。
定义与脂肪性肝炎和纤维化相关的DEG集
利用发现队列NAFLD患者的RNA序列数据，研究团队比较了NASH与NAFL的不同阶段，并观察了NASH内不同的纤维化阶段，发现了多个DEGs。为确定与从NAFL或NASH F0/F1进展到更晚期疾病相关的核心基因集特征，研究着重分析了不同成对比较之间DEG的共同性。以NAFL或NASH F0/F1为基线共有25个DEGs，其中24个随着疾病的进展逐渐增加，1个基因（HSD17B14）显示逐渐减少。当比较NASH F2-F4和NAFL NASH F0/F1组合时，这25个基因都存在差异表达。
图2. 不同疾病级别和两个集群中的基因特征对比。来源：Sci Transl Med
研究团队进一步分析了基因表达变化与组织学表型组成部分之间的关系，发现25个基因都与炎症、肿胀和纤维化的严重程度密切相关，其中12个基因显示与脂肪变性的额外重叠，21个基因可将轻度疾病与晚期疾病区分开。
基于25个基因特征整合单细胞RNA测序分析识别细胞簇
通过将健康和肝硬化样本中的公开可用的scRNA序列数据映射到按纤维化阶段分组的RNA序列数据上，研究人员进行了综合的单细胞RNA测序分析。最终鉴定了上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等，并从健康和肝硬化scRNA序列数据组合中识别出八个不同的上皮细胞簇。肝硬化中的一个特定簇同时表达25个基因中的10个，并发现上述上皮簇在晚期NASH中高表达，在NASHF4中的富集最强。该研究根据25个基因标记表达整合单细胞RNA-seq分析确定了不同的细胞群体，并发现在NAFLD进展过程中肝内不同细胞群体发生了动态变化。
图3. 利用单细胞RNA-seq数据鉴定上皮细胞内的不同细胞簇。来源：Sci Transl Med
随后，研究团队发现肝脏转录组变化也可在患者外周血中检测到。在305例NAFLD患者血清样本中可检测到13种蛋白质，反映了25个基因中的14个。因此该研究发现的DEG基因集的循环蛋白浓度或可反映疾病的组织学严重程度，用于未来潜在生物标记物的开发。
图4. 从25个基因标记中检测出的蛋白质及其与组织病理学特征的相关性概述。来源：Sci Transl Med
在NAFLD进展过程中肝基因表达的模式可提高对疾病分子机制的认识，并可能有助于确定治疗靶标。此前的一些研究曾试图解决NAFLD的转录组变化，但受到技术方法的限制，基因覆盖范围较小，总体样本量少。该研究综合转录组学分析，通过代表NAFLD完整组织学特征的大型独立队列，利用RNA-seq检测了疾病发展过程中肝脏基因表达的变化，发现了更广泛的基因表达变化，并与从NAFL到NASH的过渡以及进展为纤维化和肝硬化有关。