原标题:无需病毒载体！《NBT》发表新型纳米脂质颗粒CRISPR运输系统，可高效进行基因编辑

作为目前应用最为广泛的基因组编辑工具，CRISPR-Cas9系统以操作简单、灵活性好、识别和切割效率高等优点，在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命。科学界认为它具有用于基因治疗的潜能，自诞生之日起便被给予厚望。但CRISPR-Cas9系统也并非完美，在使用中可能会产生严重的脱靶效应，无疑为这项技术的使用带来了隐患。目前，全世界许多研究人员正致力于开发更加高效的基因编辑系统，也有很多团队致力于解决基因编辑中脱靶效应的问题。

目前，CRISPR最常用的运输系统大多以病毒为载体，例如腺相关病毒（AAV）。然而，正如今日发表在《自然·生物技术》期刊上的一项研究指出的，理想的CRISPR-Cas9传递系统应限制细胞暴露于基因编辑技术的时间，以便将潜在的脱靶效应降至最低。此外，CRISPR-Cas9系统中广泛使用的spCas9酶很难适应典型的AAV载体，患者也会对AAV产生免疫反应而限制重复给药。

为了应对这些挑战，麻省理工学院的研究团队日前通过对向导RNA（sgRNA）进行化学修饰，开发了一种非病毒的CRISPR运输系统。研究人员首先找到了在维持或加强基因组编辑活动的同时，可以耐受化学修饰且不抑制与Cas9相互作用的sgRNA区域。在这一区域下，研究人员可以对sgRNA进行增强，但不影响接下来的基因编辑。最后，研究人员证明了单剂量的“增强版sgRNA”（enhanced sgRNAs，e-sgRNA）与Cas9 mRNA的结合，可以在活鼠的肝细胞中几乎完全实现一个目标基因的编辑，无需借助病毒的传输系统。

具体而言，科学家首先对sgRNA进行了分析，以探索可以对sgRNA进行何种程度的化学修饰。他们设计了HEK293细胞以稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）和spCas9，并引入了一种靶向GFP的功能性sgRNA，来消除GFP的表达。研究人员指出，这项实验帮助他们确认了sgRNA对哪些修饰具有良好的耐受性，以及它对基因编辑能产生的影响。随后，在确认了效果最好的化学修饰后，研究人员进一步验证了他们自己开发的“增强版”sgRNA的编辑效率。最后，研究人员将靶向GFP基因的“增强版”sgRNA制作成一种纳米脂质颗粒（LNP），并将纳米粒子注入小鼠肝脏内，对机体内的e-sgRNA进行评估。

为了评估纳米脂质颗粒CRISPR运输系统用于体内基因编辑的潜能，研究小组还设计了两种靶向小鼠PCSK9基因的e-sgRNA，这是治疗家族性高胆固醇血症的重要靶点。他们将Cas9 mRNA和两种e-sgRNA封装在纳米脂质颗粒中，并发现，在单次静脉给药5天后，小鼠血清中已检测不到PCSK9，血清总胆固醇降低了35％~40％。

研究人员写道：“我们在肝脏基因组DNA中发现了总计83%（±3％）的基因编辑事件，包括小片段插入缺失、两种sgRNA引起的主要基因组缺失以及较低的倒位。”此外，他们还测量了小鼠肺和脾中的基因编辑效率，以确定这一方法处理后可能的脱靶事件，并发现在这些部位无法检测到基因编辑水平，这表明研究中使用的LNP具有肝特异性。

考虑到非病毒运输系统的潜在优势，例如易于放大试验、定制速度快、无预存免疫性以及以及限制暴露核酸酶的可能性等，这种方法在治疗环境中格外具有吸引力。此外，除了e-sgRNA的潜在治疗应用外，这种高度修饰的sgRNA可以整合到一系列CRISPR相关技术中，如CRISPR介导的成像、活化和抑制靶向基因。研究人员最后谈道：“我们相信，利用纳米粒子永久修改活体动物基因组为一系列的治疗和工业应用打开了大门，并进一步推动了Cas9基因组编辑系统的实用性。”

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