原名：Multi-omics analysis reveals the influence of tetracycline on the growth of ryegrass root

译名：多组学分析揭示了四环素对黑麦草根系生长的影响

期刊：Journal of Hazardous Materials

IF：10.588

发表时间：2022.04（2020, 435: 129019）

第一作者：韩涛（河南科技学院）

通讯作者：葛世栋（河南农业大学）

环境因素，包括抗生素，如四环素，可以改变植物的生理过程。为了了解细胞/组织对四环素的响应，采用多组学方法探讨四环素影响黑麦草根系生长的分子机制。四环素引起植物根系代谢广泛变化，特别是对类黄酮代谢途径相关基因和代谢物的影响，揭示四环素胁迫下类黄酮的变化。本研究由百迈客提供代谢组、转录组和蛋白质组技术服务。

Graphical Abstract

1. 黑麦草根系对四环素极为敏感

四环素胁迫会限制黑麦草幼苗的生长，尤其是根系的生长。为了帮助理解四环素如何影响黑麦草根系的生长，通过生长模型发现，黑麦草根系表现出极端的生长抑制，但尚未出现强烈的叶生长抑制。通过测定黑麦草根系的代谢组、转录组和蛋白质组，从主成分分析可以看出，四环素对黑麦草根系的代谢物和基因有显著影响。

图1 代谢组(a)、转录组(b)和蛋白质组(c)的主成分分析

2.四环素严重影响根系代谢组

为了评价四环素如何影响根的代谢活性，采用LC-MS在黑麦草根中获得了821种代谢物。其中有230种代谢物 (P < 0.05, fold change (FC)>1.20或< 0.83)显著上调或下调。

图2四环素改变了代谢组，特别是次生代谢和脂质代谢。a、代谢物的热图谱聚类，显示代谢物的相对含量。b、差异代谢物根据其功能/通路的综合性进行聚类。 圆的大小与折叠变化(FC)值成正比。 红色表示在四环素中有更高的FC (T)，而蓝色表示在对照中有更高的FC (C)。c、受四环素影响的代谢途径相关代谢物的箱式图。 *在P < 0.05时差异显著，**在P < 0.01时差异显著。

将230个代谢物基于其功能/通路的富集发现黑麦草根的次生代谢发生了很多明显的变化。其中芦丁、槲皮素、异槲皮苷(槲皮素-3- o -葡萄糖苷)、柚皮素、没食子儿茶素和山柰酚的含量大幅下降。它们通过莽草酸和苯丙氨酸的代谢途径产生。许多下调的类黄酮物质是抗氧化剂，在黑麦草的根中，这种保护反应被抑制，从而加重氧化应激。在四环素胁迫下，胁迫激素水杨酸及其相关代谢物5-甲氧基水杨酸的含量也降低了。类黄酮代谢在水杨酸诱导机制中起着重要的作用。水杨酸能增加类黄酮物质的积累。然而，与应激激素脱落酸相关的代谢物脱落酸葡萄糖酯(ABA-GE)在四环素处理下显著增加，也与类黄酮的生物合成相关。已有研究报道，激素吲哚-3-乙酸在合适的浓度范围内是植物的生长促进剂。在这里，5-甲氧基吲哚-3-乙酸（一个吲哚-3-乙酸类的成员）在四环素处理降低。然而，另一种激素吲哚-3-丙烯酸在四环素处理下增加，其对植物生长有抑制作用。

黑麦草根中与脂类代谢有关的物质(脂肪酸、磷脂、单萜类、甘油脂类、类固醇和其他脂类产物)也发生了变化。黑麦草根中许多脂类分解产物减少，脂肪酸增加。例如，脂分解中间体1-棕榈酰甘油和脂分解产物胆碱、磷脂胆碱、磷脂酸(16:1/18:3)、磷脂酸(18:3/18:3)、溶血磷脂酰胆碱(12:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)、溶血磷脂酰胆碱(16:1)含量在四环素处理下降低。相反，γ-亚麻酸、花生四烯酸和羟基脂肪酸脂肪酸酯(18:2/20:4)含量明显升高。我们观察到磷脂酰胆碱的含量没有变化，而在四环素胁迫下脂解产物(磷脂和胆碱)下降，表明不饱和脂肪酸刺激了磷脂酰胆碱与磷脂酰胆碱的结合。磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺的比值增加，保护了膜的完整性。这些表明黑麦草的根中存在一种保护反应，能够改善氧化应激。

3.四环素胁迫下根中类黄酮代谢基因下调

与对照组相比，在四环素处理下，10406个转录本显著下调或上调(P< 0.05和FC>2.00或<0.50)。通过富集分析发现这些差异基因参与糖酵解/糖异生、精氨酸生物合成、氨基酸生物合成、碳代谢、丙酮酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、脂肪细胞脂解调节、昼夜节律诱导、cGMP-PKG信号通路、鞘脂信号通路、氧化磷酸化等生理过程。四环素胁迫下，黑麦草根系内质网蛋白加工、2-氧羧酸代谢、细胞凋亡等显著增加(P < 0.05，增加80%以上)。相比之下，类黄酮合成和花青素合成显著降低(P < 0.05，下降80%以上)。

图3 四环素改变转录组。a、差异转录本的热图聚类。b、差异转录本的KEGG。 圆越大，差异就越大。因子越高，富集程度越大。 红色表示T中KEGG表达上调，蓝色表示T中KEGG表达下调(P < 0.05，上调或下调80%以上)。c、受四环素影响的代谢途径相关转录本的例子。

4.四环素胁迫下根中类黄酮代谢蛋白下调

与对照组相比，在四环素处理下有273种蛋白质发生了显著变化(P< 0.05)。KEGG富集分析发现，这些差异蛋白与类黄酮生物合成、氧化磷酸化、RNA降解、植物昼夜节律和α -亚麻酸代谢相关。最显著的是，在四环素胁迫下，与RNA降解相关的蛋白显著增加(P < 0.05，增加80%以上)。黄酮类化合物的生物合成和氧化磷酸化显著减少(P < 0.05，下降80%以上)。与转录组结果一致，黄酮类化合物的生物合成通路也是显著降低。

图4四环素改变蛋白质组。a、蛋白质的热图，显示蛋白质的相对含量。b、基于蛋白质的log2FC (T/C)和- log10p值的蛋白质火山图。 点曲线P = 0.05或FC = 1.5/0.67。 红色和蓝色分别表达上调和下调的蛋白。c、差异蛋白的KEGG。 红色表示T中KEGG表达上调，蓝色表示T中KEGG表达下调(P < 0.05，上调或下调80%以上)。d、受四环素影响的代谢途径相关蛋白的例子。

5.四环素胁迫下的代谢过程

我们使用多组学分析来绘制四环素如何在转录和转录后水平上影响单个代谢过程。通过脂类和类黄酮(苯丙烷)的简化代谢过程，研究了相关酶或其类似物/亚型的代谢通量、mRNA和蛋白质含量。四环素诱导的mrna和蛋白质含量的主要变化与代谢产物的变化相一致。例如，脂肪分解的减少与磷脂酶mrna含量的部分下降有关，而磷脂酶mrna含量的下降反过来又强烈地降低了胆碱、磷胆碱和磷脂酸的含量。尤其是催化磷脂酰胆碱转化为磷酸胆碱的磷脂酶C，其mRNA水平下降了35%。但根中磷脂酶含量与对照无显著差异。与脂质代谢相反，与类黄酮(苯丙烷)代谢相关的代谢物的变化似乎是由mrna和蛋白质的共同变化介导的，而这些变化反过来，全部或部分地改变了相应代谢物的含量。黄酮类代谢产物(柚皮素、山奈酚、槲皮素、异槲皮素和芦丁)的减少与关键上游酶(查尔酮异构酶)mrna和蛋白的减少有关。类黄酮生物合成代谢产物(咖啡酸、阿魏酸和香草醛)的不变性与关键下游酶(咖啡酸3- o -甲基转移酶和4-香豆酸辅酶a连接酶)的mrna和蛋白质的稳定性有关，这表明在四环素胁迫下可能存在一种协同的类黄酮(苯丙烷)调节因子。

结 论

我们通过多组学来量化黑麦草转录本、蛋白质和代谢物，为检测四环素在根中的整体影响提供了一种有效的方法。将这些变化分配到细胞/组织过程中，然后确定可能受四环素影响的代谢途径，通过比较mrna和蛋白质的变化可以很好地理解这些变化，从而确定这些变化是由转录和/或翻译驱动的。通过这种方法，我们确定了四环素对次生代谢、脂质代谢、氨基酸代谢和碳水化合物代谢的影响。综上所述，多组学分析为四环素胁迫下黑麦草根系的众多细胞过程提供了全面的数据集。