原标题:蛋白桑：药用真菌桑黄的研究进展

[摘要] 桑黄（phellinus）作为寄生在桑树上的真菌，在2 000多年前就有用作珍贵中药材的记载，在调节机体免疫、延缓衰老和抗肿瘤等方面具有良好的功效。该文综合近几年国内外有关桑黄的分类学问题、活性成分、药效及其作用机制、提取工艺等方面的研究进展进行阐述，并对目前存在的问题及今后的研究方向进行了探讨。

[关键词] 桑黄；分类学；活性成分；抗肿瘤；药效机制；提取工艺桑黄作为我国传统的中药材，最早记载于《神农百草经》和李时珍的《本草纲目》，主要用于止泻、崩漏带下、脾虚泄泻，此外还能利五脏、排毒、活血。在20世纪70年代就已经认识到桑黄的抗肿瘤效果，在过去的30年里，其20多种药效逐渐为人们所探知，如增强机体免疫、保肝护肝、治疗关节炎等；其相关药用成分也被逐渐提取出来，纯化工艺也不断得到改进。本文综合近几年研究成果，现对桑黄有效成分的药理学机制等几个方面进行阐述。

1 桑黄的分类学地位

“桑黄”是硬质的多孔菌，根据2011年吴声华、戴玉成的鉴定结果，桑黄属于担子菌门Basidiomycota刺革菌目Hymenochaetales刺革菌科Hymenochaetaceae。作为珍贵的药用菌种，传统叫法中的“桑黄”是多个种的统称，包括鲍氏针层孔菌Phellinus baumii， 火木针层孔菌P. igniarius和裂蹄针层孔菌P. linteus等， 属于针层孔菌属Phellinus Quel。直到2012年，吴声华从各地取得相关标本，分析其形态学及核糖体内转录间隔区核糖序列，发现真正的桑黄是一新种Inonotus sanghuang，分布于中、日、韩三国，野外仅生于桑属Morus的树干，几近绝迹，很难寻找。而被广泛误认为桑黄学名的P. linteus并不生长在桑树上，P. baumii则生长于丁香属Syringa的枝干，而P. igniarius生长在多种阔叶树上。人们对桑黄的应用和研究往往也以赝品或少数真品的混杂种类为据。综合多篇文献，发现其中研究较多，药效认可度较高的有针层孔菌属的P. baumii，P. linteus和P. igniarius 3个种，并将其中有共识的研究成果整理，本文沿用过去的叫法统称这些种为“桑黄”。

2 桑黄的活性成分及其分子结构

桑黄主要寄生于桑、杨、暴马丁香、松、白桦等树干上[8]。桑黄的化学成分有多糖、黄酮、香豆素、麦角甾醇、落叶松覃酸、脂肪酸、三菇类、芳香酸和多种氨基酸，以及木糖氧化酶、脲酶、醋酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、乳糖酶、纤维素酶等多种酶类。有研究统计，桑黄的药理学功能有20多种，包括抑菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤、加强机体免疫、保肝护肝、降血糖、降血脂、抗肺炎等，其有效成分主要是多糖、黄酮、三萜和酚类物质（表1）。

齐欣等[8]对6种不同树种的桑黄药效成分进行了比较，结果表明，桑树桑黄子实体中多糖、黄酮和三萜的含量均高于其他树种；因生长的树种不同，在药效成分含量上也有所差异。王钦博[12]认为一年生桑黄子实体多糖、黄酮类和三萜的含量要略高于二年生，抗氧化活性也优于二年生桑黄；此外，菌丝体和子实体中多糖含量也有所差异，回晶等[9]对P. igniarius进行了研究，发现其菌丝体中多糖含量是子实体的1.55倍。

2.1 桑黄多糖 桑黄子实体多糖以杂多糖为主，主要的单糖有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖。小分子多糖的单糖组成为β-D-半乳吡喃糖，大分子多糖的单糖组成为β-D-葡萄吡喃糖，β-D-葡萄糖单元通过（1→3）键连接形成直链多糖。近年来，桑黄多糖的提取鉴定有了新的进展，如Baker等[16]从P. baumii中分离到的水溶性多糖主要由葡萄糖和甘露糖单体构成，其结构主链为β-（1→3）葡聚糖，支链为β-（1→3）甘露糖并通过β-（1→6）糖苷键连接于主链；葛青[13]从桑黄子实体提取到活性葡聚糖PBF6，其葡萄糖单体以1，6和1，3连接2种形式存在，其摩尔比为1∶2，主链结构为→3）-β-D-Glcp-（1→3）-β-D-Glcp-（1→6）-β-D-Glcp-（1→。Yang等[17-18]在2007年从P. igniarius的子实体中分离到一种大小为1.71×10

Da的杂多糖PIP60-1，由5种单糖包括L-岩藻糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖和3-O-Me-半乳糖按1∶1∶1∶2∶1组成（图1）；并于2009年分离到1种大小为22 kDa的杂多糖PISP1，其包含4种单体岩藻糖、半乳糖、甘露糖和3-O-Me-半乳糖按1∶2∶1∶2组成（图2）。

2.2 黄酮类化合物 黄酮类化合物具有很好的抗黄嘌呤氧化酶、抗氧化、抗突变活性。莫顺燕等利用萃取、柱色谱、反向HPLC等技术从P. igniarius子实体成功分离到7种黄酮化合物：柚皮素（4′，5，7-三羟基二氢黄酮），樱花亭（4′，5-二羟-7-甲氧基二氢黄酮），二氢莰非素（4′，5，7-三羟基二氢黄酮醇），7-甲氧基二氢莰非素（4′，5-二羟基-7-甲氧基二氢黄酮），北美圣草素（3′，4′，5，7-四羟基二氢黄酮），桑黄黄酮A（5，7，4′-三羟基-6-2″-羟基苄基二氢黄酮），桑黄黄酮B（5，7，4′-三羟基-8-2″-羟基苄基二氢黄酮）。其中，桑黄黄酮A和B为2个新发现的化合物。

2.3 三萜类化合物 桑黄中已知的三萜类化合物有软木三烯酮，β-乳香酸，熊果酸，natalic， torulosic acid，albertic acid， pomacerone，javeroic acid，phellinic acid等[14， 23-26]。2009年，Liu等[27]从P. Gilvus中提取出4个新的羊毛甾三萜：gilvsins A，B，C，D。其中gilvsins A是一种针状晶体，结构式为22-hydroxy-24-methylenelanost-8-en-3-one；gilvsins B作为白色非晶体粉末，其结构式为3β-，22R-dihydroxy-24-methylenelanost-8-en-28-oic；gilvsins C结构式为22R-hydroxy-24-methylene-29-norlanost-8-en-3-one；gilvsins D的结构式为22R-hydroxy-24-methylene-3-norlanost-8-en-oic。随后，Wang[28]从P. igniarius子实体中分离到4种新的羊毛甾类三萜igniarens A， B， C， D：22R-hydroxy-24-methylene-29-norlanost-7，9（11）-dien-3-one（A），3α，22R-dihydroxy-24-methylene-29-norlanost-7，9（11）-diene（B），3α，22R-dihydroxy-24-methylene- 29-norlanost-8-ene（C）和3α，22R -dihydroxy-24-methylenelanost -8-ene（D），4种化合物均为非晶体固体，其中化合物B和D可以显著抑制由LPS诱导的细胞一氧化氮（NO）合成。

2.4 吡喃酮类化合物 近几年，国内外关于吡喃酮药效的研究较多。吡喃酮是桑黄中的一类多酚类色素，有苯乙烯基吡喃酮（hispidin）骨架和苯并吡喃酮骨架。苯乙烯基吡喃酮骨架（styrylpyrones）一般由多个hispidin[6-（3，4-dihydroxystyrl）-4-hydroxy-2-pyrone]，或由hispidin与hispolon[6-（3，4-dihydroxyphenyl）-4-hydroxy-3，5-hexadien-2-one]缩合而成，具有很好的抗氧化、抗突变、抗肿瘤和降低血糖的功效。1996年，Ali等从纤孔菌属中分离到hispidin和hispolon，并对其分子结构进行了鉴定，确定为酚类化合物；Mo等从P. Igniarius中提取到3种吡喃酮类化合物，经验证具有护肝的功效；2010年，Lee等从P. Baumii中提取到一种新的苯乙烯基吡喃酮baumin（图3），分子式为C 27 22 11，为黄色粉末，具有很好的自由基清除能力，能抑制由Fenton 反应引起的DNA超螺旋断裂。

2.5 其他活性物质 Wu等[40]从P. igniarius中分离到4种甾体，还有1种homopregnene、3种heptanorergosterane以及9种倍半萜。其中，3β-hydroxy-11，12-O-isopropyldrimene具有良好的血管舒张效果，能够有效缓解苯肾上腺素诱发的血管收缩。吴秀丽等[41]从发酵液和菌丝体中提取到29个新的化合物，其中化合物豆甾-7，22-二烯-3β，5α，6α-三醇、环（L-亮氨酸-D-脯氨酸）有神经细胞保护活性，环（苯丙氨酸-丝氨酸）、环（6-羟基-脯氨酸-苯丙氨酸）有肝细胞损伤保护活性。

3 桑黄的主要功效及作用机制

3.1 免疫调节 研究表明，免疫调节是多糖类物质最基本的药理作用，桑黄多糖的许多活性作用如抗肿瘤、保护肝损伤、降血糖、抗氧化等都与其免疫调节功能有关。桑黄蛋白多糖可以激活蛋白激酶C（PKC）和蛋白酪氨酸激酶（PTK）信号通路从而激活机体B淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，并提高对自然杀伤细胞（natural killer cell， NK）和LAK（lymphokine activated killer）的活性。傅海庆等用桑黄口服液饲喂小鼠，发现高剂量组小鼠的脾脏和胸腺重量显著增加，吞噬细胞的吞噬能力提高；桑黄多糖还能够显著提升Th1细胞的功能，Th1细胞属于辅助性T淋巴细胞，在正向调节细胞免疫中发挥重要作用。

3.2 抗氧化、防衰老作用 人体内的自由基是衰老和一些疾病发生的原因之一，当体内自由基产生过多或清除过慢时，各种细胞、组织和器官就会受到损伤，进而加速机体的衰老并诱发各种疾病。而桑黄的酚提取物hispidin对超氧阴离子、羟基自由基和 DPPH 都具有一定的清除作用；桑黄多糖能保护线粒体DNA免受活性氧基团造成的损伤，防止线粒体功能紊乱；Yuan等从P. ribiis中提取多糖，发现能降低血液中丙二醛（MDA）含量，同时加强血清中超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性；祝子坪等采用化学模拟体系测定桑黄胞内多糖与胞外多糖体外抗氧化能力，发现桑黄多糖抗氧化能力有明显的量效关系，且胞外多糖与胞内多糖在清除羟基自由基、超氧阴离子、DPPH等方面能力不同；Kozarski等[59]以桑黄多糖为材料，通过测定其还原能力来研究抗氧化能力。结果显示，一定范围内，桑黄多糖提取物的还原能力随着样品浓度提高而明显增加，随后还原能力保持稳定不变。Lee等认为桑黄的抗氧化能力与其含有大量的多酚类物质有关；王钦博等对桑黄的子实体中的抗氧化成分进行了分离纯化，将得到的化合物进行清除超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基、NO自由基等抗氧化实验，发现分离到的一种吡喃酮类化合物（C1518）在清除自由基及其它抗氧化方面均有显著活性，对损伤的PC12神经细胞也有很好的修复能力，并能延缓其衰老。

3.3 抗肿瘤作用 桑黄具有明显优越的抗癌能力，其提取物能够有效抑制包括人类结肠癌细胞系SW480等细胞的增殖，可以显著提高机体免疫能力，并能降低化疗药物造成的免疫系统损伤，对环磷酰胺起着增效减毒作用，延长小鼠存活时间。温克等比较了桑黄，灵芝，阿加里斯茸，PL-2.PL-5 4种药物对小鼠移植性胃癌和S180肿瘤的抑制作用，结果显示桑黄在4类药物中具有较好的肿瘤抑制效果。

桑黄的抗肿瘤能力主要与3个方面相关。

①加强机体免疫应答。王超�等研究了火木层孔菌等6种桑黄的石油醚提取物对小鼠的抗肿瘤活性影响，发现6种提取物均能增加小鼠各免疫器官指数，从而提高荷瘤小鼠的机体免疫力；Kim G Y等认为桑黄多糖能够通过蛋白激酶C（PKC）和蛋白酪氨酸激酶（PTK）途径来刺激B淋巴细胞的增殖，通过上调NO和肿瘤坏死因子（TNF）的表达来激活T淋巴细胞介导的特异性免疫。此外，桑黄多糖还能促进自然杀伤细胞、巨噬细胞介导的非特异性免疫，以及辅助性T淋巴细胞Th1的功能，来加强细胞免疫。②抑制肿瘤细胞分裂。桑黄蛋白多糖不仅可以保护T细胞免受前列腺素E2（PGE2）的抑制，加强免疫球蛋白A（IgA）的应答，而且可以阻断RegⅣ介导的EGFR/Akt信号转导通路，而这一通路可以加速细胞的恶性增殖；Li等[77]用桑黄多糖处理肝癌细胞，可以使细胞周期阻滞于S期，定量分析发现癌细胞的钙网蛋白、周期蛋白D1、周期蛋白E和周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）的表达量明显下调，同时周期蛋白A和p27的表达上调，说明桑黄多糖诱导的细胞周期阻滞是由钙网蛋白和p27-cyclinA/D1/E-CDK2 信号通路介导；Lu等[33]发现桑黄酚类提取物hispolon可以有效抑制乳腺癌和膀胱癌细胞的增殖，其癌基因表达的蛋白MDM2被泛素化降解，进而活化ERK1/2（extracellular signal-regulated 1/2）提高癌细胞对hispolon的敏感性。

③诱导肿瘤细胞凋亡。桑黄提取物hispolon可以诱导急性骨髓性白血病（AML）细胞凋亡，通过qRT-PCR、western blot等技术发现经hispolon处理的AML细胞中，caspase-8， -9， -3的表达量明显提高，同时ERK1/2，p38，JNK1/2的磷酸化水平增加，且呈剂量效应关系；当使用siRNA特异性干涉JNK基因后， hispolon诱导的caspase-8， -9， -3活化明显受阻；此外，hispolon降低了Bcl-2的水平，增加线粒体膜的通透性，释放细胞色素C，从而活化caspase-9；因此，Hsiao等认为hispolon通过2种途径引起细胞凋亡：一方面促进JNK1/2的磷酸化，促进前体caspase-8， -9切割成成熟的caspase-8， -9；另一方面促进线粒体释放细胞色素C，活化caspase-9。成熟的caspase-8和caspase-9进而切割下游靶蛋白，最终切割DNA成片段，引起细胞凋亡（图4）。桑黄多糖（PL）还可以直接调控caspase 2的活性来启动前列腺癌细胞的凋亡。

3.4 保肝、抗肝硬化 在2002年，张万国等就曾证明桑黄能减轻肝细胞损伤，预防大鼠肝纤维化的发生；随后研究发现桑黄能显著改善肝脏微循环，增加肝细胞营养补给；提高肝组织SOD活性，降低脂质过氧化产物MDA；促进肝细胞再生；抑制肝星状细胞（HSC）和成纤维细胞增殖及胶原合成；提高大鼠血清γ-干扰素水平，并且促进了外周血单个核细胞和淋巴细胞生成γ-干扰素，抑制炎症因子IL-4水平，且呈浓度依赖性特征。Wang等以TAA诱导大鼠肝纤维化，观察桑黄多糖对大鼠蛋白组学指标的影响，发现包括肌动蛋白在内的13种蛋白表达量有明显改变；随后对这些蛋白进行分类，发现这些蛋白分别参与氧化应激反应、亚铁血红素和铁代谢、半胱氨酸代谢、支链氨基酸代谢、能量代谢以及谷胱甘肽代谢，指出桑黄多糖抗肝纤维化至少要通过2种途径，一种途径是下调free-heme等铁相关自由基抑制氧化应激反应；另一种途径是调节氨基酸和核酸代谢，提高谷胱甘肽（GSH）水平加强肝组织抗氧化能力。

3.5 消炎、止痛 桑黄的乙醇提取物有消炎和止痛功效；Chang等对其机理做了探究，发现hispolon不仅可以缓解小鼠足趾水肿和疼痛，同时提高了肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GRx）的活性，并且显著降低了小鼠体内丙二醛（MDA）、一氧化氮和TNF-α水平。随后，Huang等[86]用另一种也具有该活性的桑黄提取物inotilone进行研究发现，inotilone还能降低一氧化氮合酶、转录因子NF-κB、环氧酶-2、MAPK和基质金属蛋白酶（MMP）-9的活性。因此，Huang认为，inotilone发挥消炎活性首先要抑制TNF-α和NO的合成，进而使MDA水平降低和SOD等抗氧化酶水平升高。

3.6 抑菌 桑黄菌丝体甲醇、正丁醇提取物和发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌均有一定的抑制作用，且对金黄色葡萄球菌的抑菌活性表现出较好的热稳定性。桑黄子实体的乙醇提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用。Won-Gon Kim等[89]从桑黄中提取到一种新的三聚体hispidin，可以有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的烯酰-ACP还原酶的活性，从而达到抑菌目的。Lee等[90]用桑黄乙醇提取物（PBE）处理巨噬细胞，PBE能显著抑制流产布鲁氏菌Br. abortus的浸染，并且引起ERK1/2磷酸化水平和F肌动蛋白聚合（F-actin polymerization）下调，Lee认为PBE通过阻断流产布鲁氏菌的胞内ERK1/2-MAPKs信号通路来抑制其在宿主内的增殖。

3.7 降糖 桑黄多糖可以显著降低血糖水平，并且呈现剂量依赖关系，并降低丙氨酸转移酶和天冬氨酸转氨酶活性[90]。Cho E J等发现桑黄胞外多糖可以显著提高过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPAR-γ）的表达量。PPAR-γ属于核受体蛋白超家族，具有转录因子的功能，其参与胰岛素的降糖作用，提高机体对胰岛素的敏感性；Kim等[95]以小鼠为材料，发现桑黄多糖饲喂过的小鼠，与对照小鼠相比，其血糖含量显著降低，胰岛细胞受到淋巴细胞的浸润程度较轻，并且炎症相关细胞因子IFN-γ等表达受到抑制。桑黄的酚类提取物hispidin可以有效清除细胞内的活性氧基团，防止过氧化氢对胰岛β细胞的损伤，从而提高胰岛素的分泌量。

3.8 抗诱变、抗突变 以环磷酰胺致畸处理小鼠后，饲喂桑黄多糖的小鼠骨髓微核率和精子畸形率较对照组显著下降，并且呈明显的剂量依赖关系。其机制可能与提高机体抗氧化防御系统，防止有害自由基对细胞内生物大分子的损伤，抑制脂质过氧化产物有关；桑黄的乙醇提取物能有效抑制叠氮化钠（NaN）、单功能烷化剂甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）等诱导的基因突变，其抗突变作用与其抗氧化活性有关。

3.9 其他活性及机制 P. baumii的乙醇提取物可以降低CD3（T cells），CD19（B cells），CD4（T-helper），CD8（T-cytotoxic），MHC class Ⅱ/CD11c（antigen-presenting cells），CD4/CD25（activated T-helper）等免疫相关蛋白的表达，抑制白细胞向红肿部位的募集，同时减少TNF-α，IL-1β和IL-6细胞因子以及免疫球蛋白IgG的释放，从而缓解小鼠的关节炎[95]。桑黄多糖还可以治疗败血性休克和抗肺炎，Kim认为其机制可能与多糖降低血清中IL-1β，IL-12，TNF-α和下调MHCⅡ水平有关[95-96]。

4 活性成分提取工艺

4.1 多糖提取 桑黄多糖的提取方法主要有热水浸提法、吸附法、深层发酵法、微波提取法酶提法以及超声法[15]；游庆红等[97]提出的水提法最佳提取工艺为固定液固比20.8∶1 （mL・g-1），99 ℃提取7.05 h，提取率达到1.133%。为进一步优化提取条件，研究者尝试其他方法如超声波提取法、超声波辅助复合酶提取法。基于纤维素酶可以切断细胞壁的β-（1，4）糖苷键，增加细胞壁的通透性，而不破坏药效成分，程伟对超声波协同纤维素酶法进行了工艺优化：超声温度54 ℃，pH 5.1，超声时间39 min，超声功率240 W。多糖得率可达到5.30%，较水提法或超声波提取法的多糖得率显著提高。

4.2 黄酮提取 夏国华用正交试验对桑黄总黄酮的超声提取工艺进行了分析，结果表明影响提取率的首要因素是提取时间，其次为料液比、乙醇浓度、提取温度。得出最佳提取工艺为70%乙醇，提取温度45 ℃，料液比1∶30，提取时间45 min。陈晓平等[102]利用响应面法对微波辅助乙醇提取工艺进行了优化，得出影响总黄酮提取含量的各因素大小顺序为：提取时间>微波时间>微波功率>乙醇体积分数。最佳提取条件为：微波时间62 s、微波功率550 W、乙醇体积分数68%、提取时间2.17 h，该条件下桑黄总黄酮提取含量为29.96 mg・g-1

4.3 三萜提取 梁佳等[103]对三萜的微波提取法进行了优化，得出最佳提取条件为乙醇浓度80%、提取时间10 min、微波功率为600 W，此条件下提取液中三萜类化合物的提取量可达1.48 mg・g-1

；于小凤等[104]用响应面法对桑黄三萜的超声提取法进行了优化：70%乙醇作为提取溶剂、料液比为1∶20（g・mL-1

），于60 ℃超声提取21 min，总三萜提取率达到了9.80 mg・g-1

4.4 多酚提取 目前关于桑黄有效成分多酚提取工艺研究并不是很多。2012年，冯子旺等[105]采用单因素试验和正交试验对多酚的超声提取工艺进行了优化。综合分析影响多酚得率的各因素后，得出多酚的最佳提取工艺为60%乙醇，超声时间30 min，超声温度50 ℃，料液比为1∶25，在此条件下，桑黄总多酚的提取率可达到26.4 mg・g-1

5 存在问题及展望

桑黄作为一种安全、有效、无毒副作用的药物，越来越受到科研及临床工作者的关注。近年来，有关桑黄的药理学作用、成分和机制逐渐得到阐明，提升了桑黄的利用率和产率。同时，也存在一些亟待解决的问题：①有关桑黄药效成分的试验仅是在体外环境下针对细胞系，或小鼠等动物进行，尚没有进入临床试验阶段；②桑黄的各种有效成分针对一种疾病是否具有协同效果或其他相互作用。相信当这些问题得到解决后，桑黄类药物的大规模生产、利用和普及将会有一个大幅度提高。