多年来，开发单克隆抗体 (mAb) 药物的路径已经得到了明确的定义和完善。但基因疗法面临的情况就不一样了。虽然基因疗法早在几十年前就开始出现了，但直到最近几年才有了进展，但是，这一领域依旧有很多未知和挑战。由于缺乏合规的流程、一致的分析和明确的监管指南，基因疗法开发者必须创建自己的商业化路径。这篇文章中三位业内科学家，就基因疗法的挑战以及如何克服这些挑战进行了探讨。

图：从左到右依次为 Michael Meagher 博士、Mani Krishnan 和 Claire Davies 博士

Michael M. Meagher 博士是圣犹德儿童研究医院 (St. Jude Children's Research Hospital) 的副总裁，负责药物生产和质量；Mani Krishnan 是 SCIEX CE & 生物制药业务部门的副总裁兼总经理；Claire Davies 博士是赛诺菲生物分析副总裁。

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挑战一：基因疗法不是传统的生物学

蛋白质药物是使用成熟的细胞系制造的。Meagher 博士说，一批蛋白质或单抗是相当均匀的，可以通过分析整个批次以确认其特性和质量。但用于基因疗法和转基因细胞疗法的病毒载体却不是这样。两到四个质粒必须转染每个细胞，并产生一个结构适合封装转基因并能产生病毒载体的衣壳蛋白。没有稳定的细胞系可以产生同样的病毒载体。每一个细胞都必须被一系列质粒复合物转染才能产生病毒载体。可以想象失败的概率和诱导异质性的程度有多高。

Davies 博士认为，改善基因疗法生产的关键是开发一致的、可扩展的平台，以提高生产产量。“低产量问题可以通过改善转染技术和载体设计来解决，以提高细胞系和病毒包装的稳定性。与此同时，更高细胞密度工艺的发展、改进的下游纯化工艺以及更好的关键原料控制将提高生产的质量和产量。”

目前实现稳健工业生产的另一个障碍是缺乏快速的分析方法。Krishnan 博士认为：“如果没有快速的检测，完全了解所有相关工艺参数，及其对产品质量属性影响的能力就很有限。这阻碍了稳健工艺的发展。当病毒载体被用来修饰细胞时，困难就增加了。”

这就是 CAR -T 细胞疗法面临的情况。无论基因运载工具是腺病毒 (AAV) 或慢病毒 (LV)，还是携带信使 RNA、引导 RNA 或蛋白质组成的基因编辑元件，其过程和产生的产物都是高度复杂的，只能在一定程度上表征。因为它们是如此复杂，观察经过基因改造的细胞随时间的变化是非常必要的。转基因造血干细胞 (HSCs) 的情况更加复杂，因为这些细胞是 “永久的细胞”，会留在患者体内。

“如果我们治疗的是一个两个月大的婴儿，在这个孩子活到 70 岁之前，我们不会真正知道治疗效果如何。”Meagher 博士说，“研发工作必须解决这一问题，我们不仅需要评估患者的长期存活率，还需要评估这些疗法的长期影响。”

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挑战二：对速度的需求

基因疗法的前景是巨大的。有超过 7000 种遗传疾病可以用基因疗法治愈。然而，尽管期望、兴趣和投资都很高，但制造和分析基因治疗产品的技术仍在进化中。许多用于制造基因治疗产品的过程借用了基于贴壁细胞的传统抗体生产过程，导致滴度非常低。同样，许多用于基因治疗的分析方法也都是传统的病毒分析方法。Krishnan 说：“虽然这些检测方法经过了试验和测试，但获得结果需要大量时间。” 例如，目前的效能、功效和其他特性的检测都是以细胞为基础的，可能需要长达三周的时间。

“同样，下游纯化后的感染研究 (TCID50) 对于确认衣壳蛋白结构也很重要，但它们可能需要长达一周的时间。为了开发一个坚实的制药生产工艺，实时检测很重要。为了开发真正优化的流程，并对是否推进一批生产做出有效决策，需要快速得到结果。”

缺乏优化的流程和及时的检测是造成基因疗法成本高的巨大因素。使问题更加复杂的是，目前许多分析方法所得的结果是可变的。有些方法的正 / 负差异为 50%。拥有坚实的、接近实时的、易于使用的、可重复的检测方法对基因疗法的进一步发展至关重要。”Krishnan 博士继续说道。“在合理的时间内提供强有力的快速检测反馈，将使能对患者产生长期可持续影响的基因疗法的发展成为可能，并完全改变游戏规则。”

Meagher 博士表示，AAV 和慢病毒载体用于基因疗法、CAR-T 细胞和 HSC (CD34+) 治疗，基于细胞的效价测定面临挑战。他解释道：“就预测效价模型的可用性而言，确定药效的技术目前是有限的，我们也非常希望有生物物理表征方法来指示功能，因为它们在加速开发流程方面是非常宝贵的，特别是对于慢病毒载体。”

其他重要的分析包括衣壳翻译后修饰的特性，生产过程中使用质粒衍生的非产物 DNA 的定量，以及空与满的衣壳比的测定。“及时进行有效的分析对开发时间线有巨大的影响”，Meagher 博士指出。

Davies 博士表示，自动化和数据分析的进步有可能减少分析耗时。完全集成的系统可以在多孔板中制备样品，自动将样品放入仪器中进行分析，然后无缝地将采集到的数据转移到分析软件中，这将简化分析，同时提高一致性和准确性。最后，她希望能够将多个设备完全集成到一个自动化的工作流程中，并能够根据仪器传感器的反馈有条件地调整仪器设置。她补充道：“如果我们能够将新的分离系统与多阀配置结合起来，在分离的模式之间进行切换，并在数据导出为通用数据格式后，将其与自动数据处理和趋势结合起来，将有助于开发完全自动化的工作流程。”

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挑战三：样本量困境

病毒载体生产过程中的滴度低导致了对检测所需样品量的挑战。在一项研究中，赛诺菲发现，用于早期临床试验的标准批次单抗生产了 2003 瓶，其中 664 瓶被用于测试，剩下的 1339 瓶用于临床研究。基因治疗的生产批量要小得多，然而，如果是全身性的治疗，那么需要检测的数量将会更高。在 Davies 博士引用的一个例子中，制造的 220 瓶中，185 瓶被用于测试，只剩下 35 瓶用于临床研究。她指出，“即使是罕见疾病，也很难确保有足够的材料用于临床试验。”

低产量和蛋白浓度仅在 0.01 mg/mL 数量级是一个复杂的挑战，因为还存在分析方法不成熟和对产品了解有限的因素。“低产量就需要有战略性的方法来减少检测量”，Davies 博士说，“由于蛋白质浓度低和一般的安全要求，基因疗法的分析需要更加灵敏。” 举个例子，根据 FDA 的指导，考虑到患者使用的平均剂量和滴度，在筛选复制能力变异的慢病毒载体时，目前需要大量（每批 10-100 升）来显示在每个患者剂量内有 < 1 个具有复制能力的慢病毒（RCL）。类似的问题也存在于具有复制能力的 AAV 中，因此显然需要显著提高用于此的基于细胞的分析的灵敏度。

她还指出，也有机会开发精益和战略性的测试 / 控制范式，使用平台技术和产品知识来减少检测量需求的稳定性测试设计。新型无损检测方法的发展作为药典方法的替代品，也将减少对检测量的要求。然而，她补充说，任何减少样本量的解决方案都必须便于质量控制 (QC)。

“我们在赛诺菲正在开发一种多属性方法，使我们能够从一个分析中获得多个重要的结果，从而减少测试所需的产本总量。”Davies 博士解释道。比如用于多种衣壳特异性和 DNA 特异性属性的方法。赛诺菲和圣犹大儿童研究医院都开发了基于毛细管电泳（CE）的高灵敏度和高分辨率方法来测定 AAV 衣壳蛋白纯度，该方法显著减少需要的样本量，且对质控友好。

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挑战四：不断发展的监管指导和持续的沟通

虽然目前对于使用重组蛋白生物制剂的基因疗法还没有建立规范指南，但是监管当局已经表示支持正在发展的基因治疗。FDA 持续制定指导文件，以支持开发和商业化这些创新的、改变生活的药物。最近，FDA 公布了关于试验药物中内毒素的指南。Meagher 博士认为，无论基因治疗产品是基于病毒载体，还是结合了 CRISPR-Cas9 等基因编辑技术，防止脱靶效应都是重点。“FDA 鼓励能快速有效地识别和量化脱靶的技术。”

他还补充说，这个领域正在以异乎寻常的速度发展：“竞争如此激烈，这太棒了，最好的技术将会胜出，这只会使病人受益，FDA 正在与基因疗法研发人员一起学习，并努力创造机会让研发人员可以与 FDA 专家讨论，来寻求最佳方法获得最安全产品。他们希望帮助企业找到前进的最佳途径。”

展望未来

Krishnan 博士认为：“为了充分发挥基因疗法在世界范围内对患者的潜力，SCIEX 等供应商将继续与研发人员合作，不断创新并推动技术向前发展，以提供从概念到临床的基因疗法所需的快速、精确、可靠和高效的分析。希望不久以后，这些流程和分析变得足够合格和完善，并能结合明确的监管指导，确保生物制药研发人员有一条良好的道路来开发和商业化基因疗法，为需要疾病修饰治疗或治愈的众多患者服务。”

Meagher 博士从研发视角提供了一个观点：“我们最感兴趣的是治疗的安全性和加速临床研究。随着快速可靠的分析技术的发展，市场将得到改善，特别是那些能够连接基于细胞的效价 / 疗效分析的方法。从长远来看，基于细胞的效价分析将是基因疗法释放检测的一部分。“当我们拥有与细胞分析相关的快速分析方法时，产品开发的时间和成本将会减少，而这一直是我们的目标。最伟大的任务是让全世界的每个病人都能负担得起这些疗法！”

Davies 博士阐明：“在生产和分析方面，基因和细胞治疗开发中的创新、战略性和数字化方法将促进我们对过程和产品的理解，为患者提供负担得起的个性化治疗。不仅基因疗法方法会不断改进和提速，而且正交工具的开发将有助于提高我们对产品质量属性及其对患者安全和疗效的潜在影响的理解。”