摘要 桑叶，为桑科桑属植物桑树(Morusalba.L)的叶子。我国安徽、浙江、 江苏、四川、湖南等地均有栽培，历代中医文献对其功能多有记载，认为其 具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血的功用。近年来，人们对桑叶的 化学成分、生理成分进行了研究，发现桑叶中营养丰富，含有人体必需的氨 基酸、维生素、无机盐、黄酮类、生物碱类等多种功能性成分。特别是生物 碱1.脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)，是植物中唯有桑叶含有的。 1.脱氧野尻霉素可以同小肠中的麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等2.糖苷酶结 合，使二糖不能进一步分解为单糖被吸收，从而明显地抑制了食后血糖值急 剧升高的现象，延缓糖尿病的发作和恶化。本实验为探讨提取工艺的科学性， 以DNJ含量为指标，通过正交试验优选其提取工艺的最佳条件，从而为实 现桑叶DNJ的工业化生产提供科学依据，具有一定的实际应用价值。 首先，研究了桑叶中DNJ的测定。本文采用DNJ衍生化后通过紫外扫 描和高效液相对其进行了定性;建立了桑叶中DNJ含量的测定方法:加入 wagner试剂为显色剂，并在紫外条件下扫描，得出其最大吸收波长为284nm， 用此方法的精密度为3.5%，加样回收率为90.68%，并且该方法在一个小时 以内相对稳定。 利用单因素试验和正交试验研究了桑叶中DNJ的提取工艺。确定酸水 提取法最佳工艺条件为:桑叶粉末粒度60日、提取温度55℃、pH3盐酸溶 液、料液比1:20、提取时间1.5h，所得提取液经分析可知，DNJ得率0.062%， 纯度为19.7%。 确定酸性乙醇提取法最佳工艺条件为:桑叶粉末粒度60目、提取温度 55℃、pH值为1的75%乙醇溶液、料液比1:30、提取时间1.5h，所得提 取液经分析可知，DNJ得率0.064%，纯度为20.3%。 在以上的基础上追加超声波强化对桑叶中DNJ的提取工艺条件:物料 粒度60目、pH3盐酸溶液、料液比1:20、超声功率150W，超声温度60 ℃，超声时间25rain，提取2次，DNJ得率0.083%，纯度26.3%。 以不同季节的桑叶为研究对象，考察了不同季节桑叶中DNJ的含量变 化。结果表明:桑叶中生物碱DNJ的含量是与生长季节有关的，3巧月份 的含量较低，6月份逐渐增高，8月份最高，9、10月份又逐渐降低。这些 变化显示，桑叶中生物碱DNJ含量与气候温度也有关，这初步揭示了桑叶 中DNJ含量随季节变化的规律。 为了对桑叶中DNJ进行纯化，本文以桑叶中DNJ的静、动态饱和吸附 量、洗脱率为考察指标，从六种不同大孔树脂优选了NKA-9对其脱附。最 佳工艺条件:上样浓度0.278mg/ml，上样流速2BV/h、径高比1:25，用80% 乙醇以2.5 Bvm流速洗脱，通过纯化，纯度由20.3%增加到58.4%。同时也 进行了001x7阳离子交换树脂的纯化效果考察。最佳工艺条件:10x300mm 层析柱，树脂用量199，最佳上样液浓度0.32mg/mL，流速为2BV/h，用 0.5mol/L氨水以1.5BV&的流速洗脱，通过精制，纯度由20.3%增加到47.6%。 为了研究桑叶中DNJ的降血糖的作用，以与人体接近的动物小肠(猪 小肠)内的蔗糖酶为对象，对桑叶中提取出来的DNJ进行了体外活性的研 究。结果表明:猪小肠蔗糖酶的酶活力与pH值有密切关系，在pH6.6时， 酶表现出最强的活力，加入抑制剂后酶活力下降。在37℃、pH6.6，当酶和 底物的浓度恒定时，抑制作用随着抑制剂浓度增大而增大。同时，当酶和抑 制剂的浓度一定时，抑制作用随着底物浓度增大而减小。确定了抑制作用类 型为竞争性抑制。以蔗糖为底物，桑叶中DNJ对猪小肠蔗糖酶的K，为 9.15x10-2mol/L。抑制剂与酶的亲和力比底物与酶的亲和力要高上4倍左右。 关键词:桑叶，DNJ，提取，纯化，活性 n 桑叶中1.脱氧野尻霉素(DNJ)的提取分离及其活性的研究 

 1绪论 桑叶，又名“铁扇子”，是桑科桑属植物桑Morusalba L的叶子。本属植物全球约16 种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。中国是桑树的故乡，也是世界上 主要的桑叶产地之一。桑属在中国已有4000多年的栽培历史，资源及其丰富，品种繁多， 主要有:家桑或白桑(Mor“s alba)、鸡桑(M.australis)、华桑(M cathayana)、蒙桑(M Mongolic)、山桑(M diabolia)等10多个品种和变种。分布于中国大部分地区，以江苏、 浙江、四川等地产量较大111。本品性寒、味甘苦，具有疏散风热、清肺润喉、清肝明目 的功能，是常用中药之一旧。中国古代药学家李时珍的传世之作《本草纲目》中记载: “桑叶可汁煎代茗，常服可令人聪明，肤色光泽，变白，轻身不老，养颜健胃，安魂镇 神称之为‘神仙叶’.《神农本草经》称桑叶为‘神仙叶’，具有滋阴补血，疏散风热、 益肝通气、降压利尿之功效。《本草图经》记载:桑叶乃手足阳明之药，汁煎代茗，能止 消渴，名目长发。《寿世保元》中以桑叶为主的扶桑至宝丹。久服不以自登上寿”。这些 记载说明了我国的古代早就对桑叶的药用价值有研究。现代药理学研究证明桑叶具有抑 制血糖上升的功能，可以用来预防和治疗糖尿病。所以桑树被称为延年益寿的圣树。正 因为桑叶的药用价值比较高，所以引起了现代科研人员的极大兴趣，并进行了详细的研 究和报道Pl。

 1.1桑叶及其成分 现代医学对桑叶的成分及功效进行了更系统的研究，迸一步证实了桑叶的药用与保 健价值I呻。据分析测定，桑叶中含有多种化学成分，介绍如下: 1.1.1桑叶蛋白质和氨基酸 桑叶中含氮量为3.3%--4.3%，粗蛋白含量约为20%一27%。具有较高的含氮量和粗 蛋白量。桑叶中含有多种氨基酸，张传惠01，日本野田信三嘲分别对干桑叶和新鲜桑叶 中氨基酸含量进行了测定。特别是桑叶中的神经传递物质、降血压物质卜氨基丁酸 (GAUA)的含量达到226m【g/1009干叶。r.氨基丁酸(GAUA)又称为r.氨酪酸。 ’ 1.1.2桑叶黄酮 桑叶中黄酮类物质占0.1%-0.3%，Kim等171从桑叶中分离到几种黄酮，分别为山奈 酚.3.氧.B.D.吡喃葡萄糖苷(紫云英苷)、山奈酚.3.氧.(6”.氧.乙酰基)-6.D.毗哺葡萄糖 苷、槲皮素.3.氧-B.D一吡喃葡萄糖苷(芦丁)、槲皮素.3.氧.B.D.吡喃葡萄糖苷、槲皮素.3. 氧-a.D.吡喃葡萄糖基.B.L鼠李吡喃糖基-B.D一吡喃葡糖苷、槲皮素.3.氧.B.D.吡喃葡萄糖 苷、槲皮素.3，7---.氧.B.D.吡喃葡萄糖苷和槲皮素。金丰秋IS]报道，每100mg干桑叶 中含异槲皮苷20-500rag，槲皮苷30mg，槲皮苦素100mg。 1.13桑叶生物碱 桑叶中含有丰富的生物碱，其中1.脱氧野尻霉素(Dig/)是一种非常重要的生物碱。 DNJ属于哌啶生物碱，其化学名称是3，4，5-三羟基-2.羟甲基四氢吡啶，是 1-dcoxynojifimycin的缩写研。DNJ的化学分子式为C6H13N04，分子量为163t珥。DNJ最 早由M.Yagi等从桑根皮中分离得到并定名为“moranoline”。这是DNJ作为天然产物 首次被分离。Yoshiaki Yoshiktmi从桑中分离出了DNJtUJ.Asan(#m等通过改变DNJ的 提取和纯化条件，从桑叶中分离出多种多羟基生物碱，包括DNJ、N-甲基.DNJ、2.氧.a.D- 半乳吡喃糖苷.1-DNJ、fagomine、1，4-二脱氧.1，4-亚氨基.D.阿拉伯糖醇、1，4-二脱氧 .1，4.亚氨基.(2.氧.吡喃葡萄糖糖苷).D-阿拉伯糖醇和la，2B，3a，4B.四羟基.去甲 莨烷等七种生物碱。桑叶中DNJ含量为0.11%嗍。桑根中DNJ含量为0.14%tt，I。 1.1.4桑叶多糖 赵俊1151等采用水提法提取桑叶中的多糖物质，产量为2.58949/lOOg桑叶。张传蕙阁 等用制备法测定鲜桑叶的多糖含量，达到2.55%，并对其化学成分进行了定性测定。 1.1.5桑叶维生素 桑叶富含多种维生素，其含量不低于鲜茶。野田信三嘲等测定桑叶中维生素含量为 视黄醛O.67mg/lOOg、胡萝卜素0.67mg/1009、VblO.59 mg/1009、Vb20.59mg/lOOg、 Vppl.35rag/1009、Vc31.6mg/1009。张传蕙151对新鲜桑叶中的维生素C含量进行了测定， 结果为每1009鲜桑叶含维生素C 65rag。 1.1.6桑叶甾醇 对桑叶中甾醇进行研究，发现lOOg桑叶中有谷甾醇46mg、豆甾醇3mg，其谷甾 醇含量比绿茶(每1009含甾酵13rag)高34倍。当前随着科技的进步，采用新技术 改造并开发桑叶资源的潜力已成为今后发展的趋势:桑蚕作为食品、药品、化妆品等原 料，进行对其有效成分的分析提纯萃取是今后发展的重点，特别是对治疗糖尿病、高血 压、癌症与爱滋病的研究也成为热点。目前的研究状况，对桑茶有效成分研究多是一些 综述性的，常规性的研究陋坶。比如，18种氨基酸的分析、测定。维生素、多糖、纤维 酸，矿物元素等分析。对黄酮类化合物、多酚物质的研究还停留在总量分析上，对其萃 取提纯并分析其单体及应用，还须进一步深入研究。

 1.2桑叶中的生物碱 1.2.1生物碱 1.2.1.1定义11%201 生物碱是指生物体内一类含氮化合物的总称，它是一类存在于生物体内(主要是植 物)、结构复杂具有生理活性的含氮碱性物质。1819年，W.Weissner把植物中的碱性化 合物统称为类碱(alli.1ike)或生物碱(alkaloids)，生物碱~名沿用至今。生物碱是科学 桑叶中1.脱氧野尻霉素(DNJ)的提取分离及其活性的研究 家们研究得最早的一类具有生物活性的天然有机化合物，它们大多数具有生物活性生物 碱类化合物绝大多数具有显著生理活性，在医学方面得到广泛的应用，它们不但在心血 管系统方面有强心、抗心率失常、舒张血管平滑肌、抗凝血功能和抗血栓的功效m铡;而 且在中枢神经系统方面发挥镇静镇痛、解热降温等中枢抑制性作用ize-291;此外生物碱类化 合物还有兴奋平滑肌I卿、保肝伫q、抗癌13tl、免疫抑制嗍、抗过敏嘲、抗炎12l翎、抗菌、抗 病毒、杀虫p61等生理作用。生物碱能和酸结合成盐，易被体内吸收。它们有的具有复杂 的化学结构. 1.2.1.2生物碱的分类与命名f”州 生物碱的分类方法有多种，常用的分类方法是根据生物碱的化学结构进行分类，可 以将它们分为有机胺类、吡咯烷衍生物类、吡啶衍生物类、喹啉衍生物类、异喹啉衍生 物类、吲哚衍生物类、昧唑衍生物类、嘌啉衍生物类、二萜生物碱类、大环生物碱类等 几大类。生物碱的命名多根据它的植物来源，例如烟碱是从烟草中提取而得名，生物碱 的名称也可以采用国际通用名称的音译，例如烟碱又叫尼古丁(nicotine)。 1.2.1.3生物碱的一般性质pal a.大多数生物碱为结晶性物质，味苦，少数为液体(如烟碱、槟榔碱)。 b.一般生物碱均无色，具旋光性，(多数呈左旋光性。)但有少数例外，如小檗碱为 黄色，胡椒碱无旋光性等，个别生物碱有挥发性，如麻黄碱。 c.大多数生物碱呈碱性反应p，卅。生物碱的碱性强弱，与它们分子中氮原予存在的 状态有密切的关系。一般季铵碱＞仲胺碱＞叔胺碱。有的生物碱分子具有酚性羟基或羧 基，因而具有酸碱两性。 RNH2 R2NH R3N P-4N+ 伯胺 仲胺 叔胺 季铵盐 生物碱的碱性虽有强有弱，但一般都能与无机酸(盐酸、硫酸)或有机酸(酒石酸) 结合成盐。 d.生物碱大多数不溶或难溶于水而溶于乙醇、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 c。一般生物碱都可以与一些特殊试剂(称为生物碱试剂，常系重金属盐类或分子量 较大的复盐以及特殊无机酸如硅钨酸、磷钨酸，或有机酸如苦昧酸的溶液)作用生成不 溶于水的盐而沉淀。利用这个性质可检查中草药中是否含有生物碱以及用以分离生物碱。 1)碘化汞钾试剂(Mayer试剂，Hgl2-KI)在酸性溶液中与生物碱反应生成白色或 淡黄色沉淀(为一种络盐A1K·HI·(HgJ2)n，AIK表示生物碱。 2)碘化铋钾试剂(Dragendorff试剂，Bil3.KI)在酸性溶液中与生物碱反应生成桔 红色沉淀(为一种络盐AIK·HI·(Bil3)n)。 3)碘化钾碘试剂(Wagner试剂，J2·KI)在酸性溶液中与生物碱反应生成棕红色沉 3 淀(为一种络盐AIK·HI·In)。 4)硅钨酸试剂(Bcn舢d试剂，12W03·Si02):在酸性溶液中与生物碱反应生成灰 白色沉淀。 5)磷钼酸试剂(Sonnenschein试剂，H3P04·12M003):很灵敏，在中性或酸性溶液中 与生物碱反应生成鲜黄色或棕黄色沉淀。 在实验时，通常选用三种以上不同的生物碱沉淀试剂进行实验，如均为正反应表示 检液中可能有生物碱存在。如须确证，则要进一步精制后，再行检验，如再次均成正反 应，即可肯定有生物碱存在。如果在第一次实验时就对三种沉淀剂呈负反应，有可能一 开始就不存在生物碱，因为有的生物碱对于颜色反应并不明显。 f.有些生物碱能和某些试剂反应生成特殊的颜色，叫做显色反应，也可以用于鉴识 某种生物碱。但显色反应受生物碱纯度的影响很大，生物碱愈纯，颜色愈明显。 常用的显色剂有: 1)矾酸铵一浓硫酸溶液(Mandelin试剂)为1%矾酸铵的浓硫酸溶液。如遇阿托品 显红色，可待因显蓝色，士的宁显紫色到红色。 2)钼酸铵一浓硫酸溶液(Frohde试剂)为1%钼酸钠或钼酸铵的浓硫酸溶液，如遇 乌头碱显黄棕色，小檗碱显棕绿色，阿托品不显色。 3)甲醛一浓硫酸试剂(Marquis试剂)为30%甲醛溶液0.2mL与10mL浓硫酸的混 合溶液。如遇吗啡显橙色至紫色，可待因显红色至黄棕色。 4)浓硫酸如遇乌头碱显紫色、小檗碱显绿色，阿托品不显色。 5)浓硝酸如遇小檗碱显棕红色，秋水仙碱显蓝色，咖啡碱不显色。 生物碱的显色反应原理尚不太明了，一般认为是氧化反应、脱水反应、缩合反应或 氧化、脱水与缩合的共同反应。 

1.2.2桑叶中的生物碱DNJ的结构 桑叶中主要含有桑色素(morin)、桑橙素(maclurin C18Hl006·H20)及生物碱(主 要有1-DNJ、N.Me.DNJ、GAL-DNJ、fagomine)类，此外还含有酚类物质，果胶，葡萄 糖，琥珀酸和腺嘌呤等。桑叶中独有的一种生物碱~一1.脱氧野尻霉素 (1-deoxynojirimycin，DNJ)19一ol，具有特殊的功能。DNJ是一种哌啶生物碱，其化学 名称是3，4，5.三羟基.2.羟甲基四氢吡啶，分子式为C6H13N04。 4 桑叶中1.脱氧野尻霉素(DNJ)的提取分离及其活性的研究 H 1.2.3桑叶生物碱的研究现状 野尻霉素首先由Inoue等作为抗生素从链霉菌中得到，DNJ是由野尻霉素氢化得到 的。DNJ的来源有两大类:植物来源和微生物来源。植物来源包括:桑叶及桑根皮，野 跖草(Commelina communis)，风信子(Hyacinthus orientalis)，沙参属植物(Adenophora triphylla var.japonia)，爵床科植物(Jacobinia suberect)。微生物来源包括浅紫灰链霉菌 GC-148(Streptomyces Lavendulae GC.148)和芽孢杆菌(Bacillus)。Yoshiaki从桑 (MorLcortex)中分离出DNJ 14司。桑叶中含量为0.11%啊，桑根中含量为0.14%。Hang Sub kim等从野跖草中分离并鉴定出DNJ，其中DNJ含量为0.01125%tn。flk蜘llio等从风信子鳞 茎的甲醇提取物中分离到了DNJ，含量为0.0012%I-J。同时也有关于在沙参属植物嗍、爵 床科植物、浅紫灰链霉菌中分离出DNJ的报道。 1.2.3.1桑叶中DNJ的提取方法 近年来，国内外对生物碱类成分的研究日趋深入。但对桑叶的研究多见于药理方面， 对其总生物碱提取分离及纯化工艺则几乎未见报道。仅悯欧阳臻对不同季节桑叶中1. 脱氧野尻霉素(DNJ)含量的测定。尽管在桑叶中生物碱的提取纯化工艺方面无直接的文献 可查，但是我们知道桑叶主含的生物碱为哌啶类，并且针对其在桑叶中的含量，则可以 根据生物碱的方法选取适当的进行分离纯化。 生物碱广泛分布于植物界，少数来自动物界，是植物中重要的有效成分之一。生物 碱在生物体内的含量一般都很低，大多数少于1%。绝大多数生物碱是利用溶剂法进行 提取的。生物碱在溶剂中的溶解度符合“相似相溶”的规律。 a传统的提取方法有147Jg 浸渍法:浸渍法是将处理过的药材用适当的溶剂在常温或温热的情况下浸渍以溶出 其中成分，该法一般是在常温下进行，对热敏性的物质的提取很有利，但所需时间长， 效率低，尤其是用水做溶剂时易发霉变质。 渗漉法:渗漉法是往药材租粉中不断添加溶剂使其渗过粗粉，从渗漉筒下端流出浸 液的方法。此方法浸出效果优于浸渍法，适用于有效成分含量低或贵重药材的提取。但 是费时较长，所用溶剂量比较大。操作相对比较麻烦。 煎煮法:煎煮法是将中药租粉加水加热煮沸，将中药成份提取出来的方法，此法简便，药中大部分成分可被不同程度的提出，但含挥发性及有效成分遇热易破坏的中药并 不宜采用此方法。 热回流法:热回流法最大的特点在于通过溶剂的蒸发与回流，使得每次与原料接触 的溶剂都是纯溶剂，从而大大提高了萃取动力，达到提高萃取速度和效果的目的。但提 取效率不高，受热易破坏的成分也不宜使用此方法。 连续回流法:此法是利用索氏提取器，多次提取生物碱，可以反复利用溶剂，提取 效率高，且操作方便。连续提取法提取液受热时间长，因此对受热易分解的成分也不适 用。 b新技术的采用 1)传统提取方法的物理场强化 (1)微波提取法(microwave assisted extraction)闱 在微波辅助提取过程中，一方面微波辐射过程是高频电磁波穿透溶剂，到达物料内 部。由于吸收微波能，细胞内部温.

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