原标题:2018年10月CRISPR/Cas最新研究进展
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基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
即将过去的10月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。
1.Science子刊：发现一种新的Cas9能够靶向基因组中将近一半的位点
doi:10.1126/sciadv.aau0766
作为一种最广泛使用的Cas9酶，来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）的PAM序列为5′-NGG-3′。在这种PAM序列中，两个连续的碱基G的存在显著地限制了SpCas9能够靶向的位点数量，仅占基因组上的大约9.9%的位点。到目前为止，只有少数CRISPR酶具有最低的PAM要求，这意味着它们能够靶向更广泛的位点。
图片来自Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aau0766。
如今，在一项新的研究中，来自美国麻省理工学院的研究人员发现一种Cas9酶能够靶向基因组中几乎一半的位点，从而显著了拓宽它的潜在使用。相关研究结果发表在2018年10月24日的期刊上，论文标题为“Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog”。他们最终发现他们寻找的一种最成功的酶为来自犬链球菌（Streptococcus canis）的Cas9（ScCas9），它与已经广泛使用的SpCas9酶非常相似。ScCas9看起来与SpCas9几乎完全相同，但是它能够靶向SpCas9不能够靶向的靶DNA序列。ScCas9的PAM序列为5′-NNGTT-3′。在这种PAM序列中，仅存在一个碱基G，这就允许ScCas9要比SpCas9靶向基因组中更多的位点：占基因组中将近一半的位点。
2.Science：重磅！发现迄今为止最小的功能性CRISPR系统---CRISPR-Cas14
doi:10.1126/science.aav4294
一群古老的包含地球上一些最小生命形式的微生物也拥有迄今为止发现的最小的CRISPR基因编辑系统。在这种基因编辑系统中，一种称为Cas14的蛋白与Cas9存在着亲缘关系，但在大小上仅为后者的三分之一。Cas9是革命性基因编辑工具CRISPR-Cas9中的一个发挥作用的蛋白组分。
虽然Cas9是从细菌中分离出来的，但是Cas14是在一群古细菌---细菌的原始亲属---的基因组中发现的。Cas9和其他的Cas蛋白是细菌进化出来的保护自己免受病毒入侵的防御系统的一部分。作为靶向酶，它们非常有选择性地寻找和结合细菌中的特定DNA或RNA序列，即那些与CRISPR记忆库中储存的序列相匹配的DNA或RNA序列，随后切割这种DNA或RNA序列，从而阻止新的病毒入侵者。与Cas9一样，Cas14具有作为生物技术工具的潜力。由于具有较小的体积，Cas14可能用于编辑小细胞或某些病毒中的基因。不过鉴于它的单链DNA切割活性，它更有可能改善目前正在开发的用于快速诊断传染病、基因突变和癌症的CRISPR诊断系统。
Cas14与Cas12和Cas13相类似，这是因为在结合到它的靶DNA序列上后，它开始不加选择地切割细胞内的所有单链DNA。相反，Cas9仅结合并切割靶双链DNA。不加选择地切割单链DNA可能是治疗中的一种缺点，但在诊断方面具有很大的优势。Cas14蛋白可与附着在单链DNA片段上的荧光标记物组合使用。当Cas14与它的靶DNA序列（一种癌基因或传染性细菌中的一种基因）结合并开始切割DNA时，它也会切割与这种荧光标记物连接在一起的单链DNA片段，从而产生荧光信号。
作为Harrington的一名同事，Janice Chen补充道，“Cas14以比Cas12更特异性的方式靶向单链DNA。这真地是一个非常意外的发现。这是因为它太小了，我们几乎认为它无法发挥作用，但是实际上，它是超级特异性的，这使得它成为诊断工具箱的一个非常强大的补充。”
Harrington、Chen及其同事们（包括CRISPR-Cas9发明人、加州大学伯克利分校分子与细胞生物学教授Jennifer Doudna），已对Cas14进行改进，使得它能够用于当前使用Cas12和Cas13快速检测传染性生物和基因突变存在的诊断系统（称为DETECTR）之中（Science, Published Online: 15 Feb 2018, doi:10.1126/science.aar6245）。Harrington、Doudna和Chen是一家名为Mammoth Biosciences的公司的联合创始人，该公司正在将DETECTR商业化。
3.Cell：突破！科学家利用新型基因条形码技术鉴别出关键的癌症免疫基因
doi:10.1016/j.cell.2018.09.022
近日，一项刊登在国际杂志Cell上的研究报告中，来自西奈山医院的科学家们通过研究开发了一种能同时分析成百上千个基因功能的新型技术，该技术的分辨率能达到单细胞水平，其依赖于一种使用新型蛋白质的条形码技术。
图片来源：CC0 Public Domain
研究人员就开发了一种新技术，其能以一种前所未有的规模来分析基因组，这或许就能够解决当前科学家们所面临的基因组学研究上的挑战。这种新工具能够利用名为表位的合成蛋白来贴上条形码并且追踪不同的CRISPRs，这种蛋白质条形码被称为优先代码（pro-code），其能够使得数百个CRISPRs一起来敲除大量基因。
当前有很多技术能够聚合CRISPRs，这些方法在很大程度上依赖于DNA作为条形码，并且只允许对基因功能进行较低分辨率的研究；而通过这种优先代码技术，研究人员就能够提供一种新方法来帮助科学家们深入理解基因的功能和生物学效应。文章中，研究人员利用优先代码技术搜寻了免疫系统保护机体抵御癌症所需要的基因，随后他们利用CRISPRs来靶向剔除推测的免疫调节基因，并将其与优先代码配对，随后将这种优先代码/CRISPRs (Pro-Code/CRISPR)文库引入到乳腺癌细胞中，这些肿瘤就会受到识别癌细胞的杀伤性T细胞的攻击和挑战，很多癌细胞就会被T细胞快速消灭，但有些癌细胞却会产生一定的耐受性。
4.Cell：重大进展！开发出让基因组重新组装的CRISPR-GO技术
doi:10.1016/j.cell.2018.09.013
在一项新的研究中，来自美国斯坦福大学的研究人员通过解除CRISPR-Cas9的“切割”功能，这种编辑工具变得更像是一种递送系统，这样就能够通过可编程的向导RNA（gRNA）将DNA片段递送到细胞核中的新位置上。这种称为CRISPR-基因组组装（CRISPR-genome organization, CRISPR-GO）的新技术使用一种经过修饰的CRISPR蛋白，从而在三维空间中重新组装基因组。如果CRISPR-Cas9像分子剪刀一样，那么CRISPR-GO就像分子镊子一样，抓住基因组中的特定部分，并且将它们放置在细胞核的新位置上。但是这并不仅仅是物理上的重新安置：改变DNA片段的位置能够改变它们的运作方式。相关研究结果于2018年10月11日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“CRISPR-Mediated Programmable 3D Genome Positioning and Nuclear Organization”。论文通信作者为斯坦福大学化学与系统生物学助理教授Lei S. Qi博士。
CRISPR-GO有三个基本部分。首先，你想要重新定位的靶DNA片段所在的“地址”---一段DNA，它能够靶向一条互补的结合RNA的链。其次，你需要目标地址---你想要将染色质移动到的细胞核区室中的特定DNA部分。最后，还存在“桥（bridge）”，在这种情形下，它是一种催化剂，它促进靶DNA片段移动到它在细胞核中的目标地址。
通过使用CRISPR-GO，这些研究人员观察到重新定位到卡哈尔体（Cajal body）---作为细胞核中的一部分，它是一团无定形的且有些神秘的蛋白和RNA ---中的基因停止表达蛋白。他们首次有证据证实卡哈尔体能够具有直接的基因调节作用。这提示着卡哈尔体在控制转录方面有一些意想不到的作用。
当Qi利用CRISPR-GO将端粒DNA ---染色体上的与长寿相关的分子帽---从细胞核的中间移动到细胞核的边缘时，端粒停止生长，从而阻止细胞周期和降低细胞活力。然而，当端粒更靠近卡哈尔体时，相反的情形发生了：它们生长，并且通过这样做，细胞活力也增加了。 CRISPR-GO的第三种应用是形成早幼粒细胞白血病小体（promyelocytic leukemia body, PML小体）。众所周知，这种蛋白团块抑制促肿瘤基因表达。通过将它放置在细胞核中的致癌基因附近，Qi计划测试它是否能够有助于抑制肿瘤形成。
5.Nat Med：碱基编辑器取得重大进展！有望在产前治疗先天性疾病
doi:10.1038/s41591-018-0184-6; doi:10.1038/s41591-018-0215-3
在一项新的研究中，来自美国费城儿童医院和宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究人员首次进行产前基因编辑来阻止实验室动物出现致命性的代谢障碍，从而有潜力在出生前治疗人类先天性疾病。这就为在产前利用一种复杂的低毒的工具高效地对致病性基因中的DNA碱基进行编辑提供了概念验证。相关研究结果发表在2018年10月的Nature Medicine期刊上，论文标题为“In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolic genes”。论文通信作者为宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Kiran Musunuru博士 和William H. Peranteau博士。
图片来自Nature Medicine, doi:10.1038/s41591-018-0184-6。
这些研究人员使用了基因编辑工具CRISPR-Cas9和第三代碱基编辑器（base editor 3, BE3）靶向编辑一种调节胆固醇水平的基因，从而降低了在子宫内接受过这种治疗的健康小鼠中的胆固醇水平。他们还在一小部分事先经过基因改造而携带着导致一种致命性肝脏疾病---1型遗传性酪氨酸血症（hereditary tyrosinemia type 1, HT1）---的突变的小鼠中使用产前基因编辑来改善它们的肝脏功能和阻止新生小鼠死亡。
6.Nat Med：在体内利用新型碱基编辑器有望治疗遗传疾病
doi:10.1038/s41591-018-0209-1; doi:10.1038/s41591-018-0215-3
苯丙酮尿症（phenylketonuria）的病因是编码苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase, Pah）的基因发生突变。这种由肝细胞产生的酶代谢苯丙氨酸。这种代谢障碍是一种“常染色体隐性”遗传疾病：儿童如果从母亲那里遗传一个突变基因拷贝和从父亲那里遗传一个突变基因拷贝，那么就会患上这种疾病。到目前为止，这种疾病仍然是无法治愈的。
在一项新的研究中，来自瑞士苏黎世联邦理工学院和苏黎世大学的研究人员利用一种方法纠正肝细胞中的两个突变基因拷贝，从而治愈这种疾病。他们取得成功，至少是在小鼠体内。相关研究结果发表在2018年10月的Nature Medicine期刊上，论文标题为“Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice”。论文通信作者为苏黎世联邦理工学院的Gerald Schwank教授。
这种由胞苷脱氨酶（cytidine deaminase）加以强化的CRISPR/Cas9系统结合到这两个需要被校正的基因拷贝上，并且在局部打开DNA双链。胞苷脱氨酶将致病性的DNA碱基对C-G转化为健康人体内对应基因组位点上存在的碱基对T-A。这能够校正Pah酶编码基因中的DNA碱基错误。通过这种方法，这些研究人员改变了成年小鼠中这两个突变基因拷贝中的碱基序列。这些经过校正的肝细胞能够产生功能性的Pah酶，这些小鼠所患的这种疾病被治愈了。
7.新研究挑战用于构建条件性基因敲除小鼠的CRISPR方法
doi:10.1101/393231
在一项新的研究中，一个由全球17个实验室组成的联盟提供的结果与一项高度引用的研究（Cell, 12 September 2013, doi:10.1016/j.cell.2013.08.022）---它描述了一种利用CRISPR构建条件性基因敲除小鼠的技术---相矛盾。这项新的研究表明与那项原始的研究相比，这种技术的效率要低得多。相关研究结果[2]于2018年9月1日发表在预印本服务器bioRxiv上，论文标题为“Re-Evaluating One-step Generation of Mice Carrying Conditional Alleles by CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing Technology”。
图片来自bioRxiv, doi:10.1101/393231。
这项新研究的结果指出了那项原始研究的局限性，后者取得的成功似乎被归因为剔除杂合小鼠品系中的特定基因。根据谷歌学者（Google Scholar）网站的统计，那项原始研究被引用了将近1000次。它的主要作者坚持认为他的方法是强有力的。
在学术会议和其他地方，一个紧密结合的研究团体针对其他实验室利用这种技术所面临的挑战开展的讨论使得主管澳大利亚国立大学转基因机构的Gaetan Burgio和他的同事们试图确定出了什么问题。
首先，三个实验室在不同的小鼠品系中复制了这项靶向同一个基因的原始实验，但没有取得成功。接下来，包括这三个实验室在内的17个实验室在5种不同的小鼠品系中针对小鼠基因组中的总共56个基因和2个基因间区域独立地重复这项实验。来自所有这些实验室的数据集经合并后包括17887个显微注射或电穿孔的小鼠受精卵和产生的1718只活小鼠，其中仅15只小鼠具有条件性对照所需的两个插入的LoxP位点。在所有接受测试的小鼠中，观察到脱靶的缺失或突变代替LoxP位点的正确插入。
与那项原始研究在小鼠中获得条件性敲除等位基因的效率为16％相比，Burgio和其他人的成功率仅为0.87％。
8.Nature：利用CRISPR/Cas系统开发出一种存储转录事件的细胞记录设备
doi:10.1038/s41586-018-0569-1
在一项新的研究中，来自瑞士苏黎世联邦理工学院和巴塞尔大学的研究人员利用CRISPR-Cas系统开发出一种新的记录设备：它产生的DNA片段能够提供关于某些细胞过程的信息。在未来，这种细胞存储设备甚至可能用于诊断中。相关研究结果于2018年10月3日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Transcriptional recording by CRISPR spacer acquisition from RNA”。
这些研究人员利用肠道细菌大肠杆菌开展研究，将来自一种不同的细菌物种的编码CRISPR-Cas系统的基因导入到大肠杆菌中。其中的一个Cas基因与一种逆转录酶融合在一起，其中逆转录酶是利用mRNA分子产生编码相同信息的DNA ---换句话说，它将mRNA逆转录为DNA。
导入这些编码CRISPR-Cas的外源基因的大肠杆菌细胞能够产生一种结合短mRNA分子的蛋白复合物。这种逆转录酶将mRNA翻译为含有与初始的mRNA相同的遗传信息的DNA，然后将它们作为间隔序列存储在CRISPR阵列中。这种过程能够多次发生，从而使得新的间隔序列以相反的时间顺序添加到CRISPR阵列，因此最近获得的DNA片段总是位于最前面。
作为他们研究的一部分，这些研究人员记录了配备有这种数据记录器的大肠杆菌对除草剂百草枯作出的反应。这种除草剂引起细胞内mRNA转录发生变化，这样他们就能够在接触除草剂几天后从CRISPR阵列中读出这种反应。如果没有这种数据记录器，大肠杆菌与这种除草剂接触的任何分子痕迹早就会被破坏，这种信息也就丢失了。
9.Nat Biotechnol：利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术从头培育出新的作物品种
doi:10.1038/nbt.4272
在一项新的研究中，来自巴西、美国和德国的研究人员首次使用CRISPR-Cas9（一种现代的基因组编辑过程）在一代中就利用野生植物中培育出新的作物。从野生番茄开始，他们引入了多种作物的性状，同时又不会丧失这种野生植物的宝贵遗传特性。相关研究结果于2018年10月1日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“De novo domestication of wild tomato using genome editing”。
图片来自Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4272。
作为亲本植物物种，这些研究人员选择了醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium），它是来自南美洲的野生番茄，也是现代栽培番茄的祖先。这种野生植物的果实只有豌豆的大小，产量低---这两种特性使它不适合作为作物。另一方面，它的果实比现代的西红柿更芳香，这是因为现代的西红柿由于育种而失去了一些味道。此外，这种野生果实含有更多的番茄红素（lycopene）。这种所谓的自由基清除剂被认为是一种有价值的抗氧化剂。
这些研究人员通过使用多重CRISPR-Cas9修饰这种野生植物，从而使得后代植物的6个基因发生较小的遗传修饰。这些决定性基因被认为是这种现代的驯化番茄特征的遗传关键。具体而言，他们对这种野生番茄的基因组进行了以下修饰而培育出新的品种：这种新品种的果实比这种野生番茄大三倍，这相当于樱桃番茄的大小。这种新品种的果实产量增加了10倍，而且它们的形状是椭圆形的，相比之下，这种野生番茄的果实是圆形的。这种属性很受欢迎，这是因为当下雨时，圆形果实比椭圆形果实更快地分开。这种经过基因修饰的野生番茄也具有更紧凑的生长。
10.Nature子刊：开发出CHAOS方法阻止抗生素耐药性超级细菌产生
doi:10.1038/s42003-018-0135-2
为了开发出可持续的长期解决方案，来自科罗拉多大学博尔德分校的研究人员在一项新的研究中，开发出一种CHAOS（Controlled Hindrance of Adaptation of OrganismS, 控制和阻止有机体的适应性）方法：利用CRISPR DNA编辑技术对细菌细胞内的多种基因表达进行修饰，从而阻止细菌性病原体中的这个至关重要的适应过程和破坏它进化出防御的能力。这些研究结果可能开辟了关于如何最好地限制细菌抗生素耐药性产生的新研究途径。相关研究结果近期发表在Communications Biology期刊上，论文标题为“Multiplexed deactivated CRISPR-Cas9 gene expression perturbations deter bacterial adaptation by inducing negative epistasis”。论文第一作者为科罗拉多大学博尔德分校化学与生物工程系研究员Peter Otoupal。
2013年，Otoupal和他的同事们开始寻找能够作为大肠杆菌的细胞杀伤开关的基因。当他们一次调整一个基因时，这种细菌能够适应并存活下来。但是当他们一次改变两个或多个基因时，这些细菌细胞变弱了。这种CHAOS方法利用这种效应，调整多个基因的表达，从而增加细菌细胞的压力并最终引发连锁反应，使得它们更容易受到当前药物治疗的影响。这种技术不会改变细菌的DNA本身，仅会改变多个基因的表达。
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