原标题:从“爆菊”到粪便基因研究-肠癌筛查技术发展简史

现代的生活方式、工作等因素使得癌症成为威胁健康的“第一大杀手”。最新癌症数据显示，我国肠癌发病率高居第五位。尤其是随着人们生活水平提高和饮食结构的改变，肠癌的发病率呈逐年上升趋势。以上海为例，结直肠癌发病率以每年4.2%的速度持续上升，早期诊断比例不足10%。

肠癌发病形势严峻，但同时，肠癌也是“最容易防治的癌症”之一。美国国家癌症研究所数据表明：“肠癌从增生到晚期，通常要经历10年左右的发展期。越靠近晚期，治疗生存率就越低。早期的小腺瘤症状不明显，一经发现，完全可以直接切除，即使是I期的腺癌，只要发现及时，生存率也高达95%。但大多数患者发现时已经是晚期（III期、IV期）了，IV期的5年生存率只有5%。”

因此，肠癌的早筛查、早发现至关重要。

由于技术手段的限制，古代对肠癌没有形成有效的筛查和治疗方法。到了近代内窥镜的出现，才开始实现对肠癌的有效筛查。下面，我们就来回顾一下主要的肠癌筛查手段，看看相比那些“古老”的筛查手段，现在医学的发展都给我们带来了什么最新的肠癌筛查方式。

18世纪初-20世纪：“爆菊”的开始

内窥镜诞生

德国科学家Bozzini发明了第一款用于直肠检查内窥镜。由于是用硬质管做成的，体验效果很差，得不到广泛的应用。1965年内窥镜用软质管制作，开启了“纤维内窥镜”时代，扩大了对于下消化道疾病的检查范围。但是，不管内窥镜如何发展，它的弊端也是显而易见：痛苦大、侵入性强，在肠镜进入的过程中有可能因为操作不当而引发消化道出血、穿孔。因此，为解决“爆菊花”的问题，科学家又开始寻找全新无创的肠癌筛查方法。

20世纪80年代：无创方法开始建立

免疫胶体金便隐血试验

免疫胶体金便隐血试验通过检测粪便中血红蛋白含量来判断结直肠癌风险，在肠癌及肠癌高风险人群的筛检方面有重要价值。但是由于结直肠癌症状较隐匿，缺乏特异的临床表现，可能出现因暂停出血或肿瘤早期无出血症状造成的漏诊，灵敏度较差。

90年代-至今

精准无创时代真正到来

随着基因检测技术的飞速发展，从90年代至今，肠癌筛查技术进入了突飞猛进的发展时期。虽然肠镜检查仍然是无可动摇的金标准，但由于肠镜筛查的痛苦，早期肠癌和癌前病变往往是没有症状的，并且一旦出现症状再去进行检查，往往已经是晚期，治疗难度大大增加。

因此，无创的肠癌筛查方式非常必要，这能够很好的提高患者依从性，提高肠癌的预防率，减少肠镜筛查带来的痛苦以及不必要的风险。

目前，无创的肠癌筛查技术主要包括了PCR检测和高通量测序，检查的样本类型包括了血液和粪便两种。

血液中DNA检测：检测血液结直肠癌细胞中SEPT9基因高度甲基化，是结直肠癌变特异性标志物之一，而正常组织中不会出现。

2015年《中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南》已将“血液SEPT9 DNA甲基化检测（mSEPT9）”纳入早期结直肠癌低危人群筛流程，但尚缺乏相关获益的研究数据。在2017年最新的美国结直肠癌筛查指南中不建议血液查SEPT9检测作为常规的结肠癌筛查手段。目前公布的数据来看：血液中SEPT9 DNA甲基化检测对结直肠癌检出率的敏感性为68%，特异性为80%^[1]。

粪便DNA PCR检测：该技术优势在于无创无痛苦，可以居家取样，同时qPCR（荧光定量PCR）技术具有仪器设备价格低廉的优势。但局限在于检测多个样本、多个突变位点时操作繁琐，且只能针对特定的位点设计方案，不能进行未知突变的筛查。并且该技术精度有限，易造成检测结果的假阴性或假阳性。此外，由于技术手段的限制，突变检测精度只能达到1%，也就是说，100个细胞中有一个肿瘤细胞可以被检出，而对于1000个细胞中有一个肿瘤细胞的低频突变则无能为力了。

2014年由美国Exact Sciences公司研发的Cologuard^®利用qPCR技术已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准临床使用，成为首个被美国FDA批准的非侵入性结直肠癌筛查试剂盒^[2]。同年相关数据已发表在《新英格兰医学杂志》（NEJM）上，结果显示通过分析粪便DNA和便隐血来筛查结直肠癌可以获得前所未有的癌前病变和肿瘤的检出率。Cologuard^®通过qPCR检测粪便中分子标志物以及便隐血检测实现结直肠癌早期诊断。2017年在美国已做57万例，预计2018年将会超过100万例。

高通量测序技术检测粪便中脱落肿瘤细胞DNA

高通量测序技术又称“下一代”测序技术(Next Generation Sequencing,简称NGS)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定为标志，具有速度快、准确率高、通量高等优点。

高通量测序用于结直肠癌早期筛查，有如下优势：

1）更多的基因检测靶标和检测内容：包括更多的检测位点和更多的基因变异/修饰类型的检测；对于癌症发生发展这样涉及多个基因，多种机制的复杂疾病，必然要求对相关的基因位点及具体变异形式进行全面的检测和分析。 而且除点突变之外，移码，缺失，融合等多种变异形式可以通过NGS方便测出，更进一步，一些与癌症病理相关但非基因编码水平变异的表观遗传学修饰也能利用NGS技术平台进行更好地判读。

2）NGS结果的高信息量有助于生成更合理的判读算法或模型：例如KRAS检测通常包含的7种突变类型在美国的肿瘤数据库中显示为频率最高的类型，但是在中国人群中会有不同的分布差异，通过深度测序积累的数据量，可以达到优化或重新定义中国人群KRAS突变检测位点的权重的目的，有助于大数据量下的机器学习方式来进行算法开发，满足技术研发的自我升级；而传统检测技术，固化的检测内容，对于判读优化的效率不高。

3)NGS方法可以实现更高的灵敏度，实现对痕量变异/修饰基因的检测：通过建库方法的优化，效率的提升，测序深度的增加，特异编码的识别，以及NGS技术平台本身性能的发展，NGS可以检测到样本中含量非常稀少的变异/修饰基因，而PCR往往对检测比例百分之一以下的突变基因无能为力；因此NGS有助于对样本内基因的真实变异/修饰情况形成更真实客观的评价。

国内已经有公司利用高通量检测技术开发了早期肠癌筛查产品，敏感性和特异性均达到90%以上。

其他无创筛查相关技术

肠道菌群：近年利用粪便菌群的检测来评估肠癌发生发展越来越受重视和关注。研究学者发现通过宏基因组高通量测序分析结直肠癌患者、腺瘤及正常人的粪便菌群样本，构建基于菌群的结直肠癌诊断模型也具有较好的诊断效果^[1]，但目前该手段仅处于研究阶段，要将这些研究结果用于临床仍需要克服一些困难，如研究的样本量、研究的技术、统计学的方法、诊断试验的局限性等。

microRNA(miRNA)：miRNA是一类具有调控作用的单链小分子RNA，与肿瘤的增殖、侵袭和转移有很大的关系。结直肠癌作为一种常见的消化道肿瘤，与miRNA有密切的关系。miRNA的出现为结直肠的早期筛查提供了新的思路^[4]，但miRNA在粪便中稳定性差，目前该手段仅处于研究阶段。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)：LncRNA的异常表达与肿瘤的发生发展、侵袭、转移等过程密切相关。结直肠癌相关 LncRNA相继被发现，均不同程度地影响肿瘤的发生发展、转移及预后。但是，其中仅有少数 LncRNA 的作用机制被阐明，人们对其他 LncRNA 调控结直肠癌的分子机制了解甚少，它们在结直肠癌发生发展中有无协同作用， 在其他肿瘤中表达水平如何，以及怎样将 LncRNA 应用于临床尚待进一步研究。相信在不久的将来，具有细胞和组织特异性的 LncRNA 有望成为一类全新的结直肠癌诊断分子标记物和新药治疗靶点标记物^[5] 。

循环肿瘤细胞(CTCs)及循环肿瘤DNA(ctDNA)：对结直肠癌的早期诊断、疗效监测、预后评估以及个体化治疗方案制定均有重要意义，已成为近年来研究的热点。CTCs 是一种可通过外周血检测的从实体瘤脱落入血液循环可引起肿瘤转移的具有肿瘤特异性抗原或基因特征的肿瘤细胞 。ctDNA是一种无细胞状态的胞外 DNA，属于游离 DNA 的一部分，主要来源于肿瘤细胞的坏死或凋亡、微转移灶或 CTCs 的裂解和增殖旺盛肿瘤细胞的释放。CTCs和ctDNA可以辅助早期诊断及良恶性判断、指导分期及分子分型、筛选药物及监测疗效、提示微转移及预后等，且非侵入性，可以多次便捷取样实现实时监测，被称为“液体活检”。随着分子诊断技术的发展，通过检测CTCs和ctDNA的基因突变和表观遗传变异如DNA甲基化将成为检测肠癌的下一代方法。但CTCs和ctDNA 在肠癌早期诊断中的价值尚需要进一步的深入研究和大规模样本的数据支持^[6]。

鉴于目前其他肠癌早筛技术的发展不成熟，仅仅停留在学术研究阶段，还需要更多权威的研究。相比较而言，基于高通量测序技术检测粪便DNA来筛查结直肠癌的产品可以期待在市场上得到更多的认可。

高通量测序技术在临床医学上展望

随着测序成本的不断降低，高通量测序技术在生命科学及医学领域方面的研究和应用越来越广泛，分析与挖掘测序得到的基因组大数据，提炼出与疾病相关的遗传变异信息，可以为疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。高通量测序技术在临床医疗中正在发挥着不可替代的作用，是推动精准医学发展的关键技术之一。

2013年11月，美国FDA审批通过MiSeqDx测序仪及配套试剂盒用于临床测试^[7]，这是高通量测序技术获得临床认证许可的标志性事件。随后，FDA紧锣密鼓地加速高通量测序技术在临床肿瘤诊断中应用。2017年11月FDA正式宣布批准纪念斯隆凯特林癌症研究中心基于NGS技术的癌症基因检测分析平台MSK-IMPACT™。通过这款产品可以详细全面检测癌症患者468个肿瘤基因突变情况,适用于任何肿瘤类型检测^[8]。短短半个月后，FDA宣布批准Foundation Medicine公司基于NGS技术的检测产品FoundationOne CDx (F1CDx)用于肿瘤临床诊断。F1CDx可诊断出包括结直肠癌在内的多种实体瘤，如非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌等^[9]。

2014 年 6 月 30 日，经国家食品药品监督管理总局(CFDA)审查，批准了华大基因BGISEQ-1000基因测序仪和BGISEQ-100基因测序仪的医疗器械注册。这是CFDA首次批准注册的第二代基因测序诊断产品，标志着我国生物技术领域基因测序关键技术的重大突破。2015年3月31日，CFDA再次批准了高通量基因测序仪（NextSeqCN500）以及无创产前检测胎儿染色体非整倍体（T13/T18/T21）的试剂盒的医疗器械产品注册和上市。

这些审批的通过，说明国内外政府机构已充分认识到精准医学是提高医疗健康水平的需要，也是现代医学发展的方向。FDA批准高通量测序肿瘤基因检测大panel对国内的监管政策也会产生巨大的影响，将会改变CFDA对高通量测序在肿瘤基因检测上的谨慎态度，变得更加积极和开放。过去与肠道抗争的痛苦时代已一去不复返，高通量测序技术也将作为肠癌的筛查利器而造福人类。