近日，数字PCR公司Enumerix开发了一种低成本的dPCR方法Ultra-dPCR。UltraPCR是一种真正的单分子DNA计数系统，使用简单且经济高效的工作流程，无需微流体，每次反应可产生多达3000万个液滴，并在现有技术的基础上大规模扩展了动态范围（dynamic range）。Enumerix预计将在2023年年底推出一种UltraPCR方法的商业产品，最初专注于研究和非侵入性产前检测市场。
Enumerix团队已在Analytical Chemistry上发表文章“Next-Generation Digital Polymerase Chain Reaction: High-Dynamic-Range Single-Molecule DNA Counting via Ultrapartitioning”，对UltraPCR方法进行了详细描述。
据Enumerix总经理Aaron Solomon介绍，UltraPCR方法不需要微流体，而是使用与标准实验室设备配对的廉价耗材。该液滴发生器是一种带有孔隙的塑料装置，适用标准的PCR 4联管。
UltraPCR工作流程：
首先利用UltraPCR TaqMan mix（Enumerix）制备反应混合物。然后将50μL的UltraPCR混合物添加到一个液滴发生器中，该发生器可以放入任何标准实验室离心机中，并装配带有Enumerix专有乳化物的PCR 4联管。将UltraPCR混合物以16,000g离心20分钟，依靠离心力喷出的液滴进入PCR管。每次离心最多完成12组（48个样品）。离心后，分离液滴发生器，将装有乳液液滴的PCR管密封，放入Bio-Rad C1000 PCR仪中进行扩增。同时将相同的PCR联管放入3D成像仪（Enumerix）中进行DNA阳性液滴扫描。
图1：UltraPCR工作流程。
据文章介绍，UltraPCR方法通过离心可将每50μL混合物分成> 3000万个液滴，利用有限稀释实现单分子分离，轻松扩展超过100万个DNA分子。UltraPCR平均液滴直径为14.1μm，与另一项使用离心分离法的研究相比，UltraPCR的液滴体积仅为其1/25，是目前市售dPCR系统液滴体积的1/500。同时，UltraPCR生成的液滴数量是可调的，因为UltraPCR液滴发生器也适用于灵活的反应体积，如qPCR。对于浓缩DNA检测，可以使用较低的反应体积（如20μL生成约1200万个液滴）以最大限度地降低试剂成本。
图2：单分子液滴与DNA输入。即使在100万个DNA输入拷贝时，UltraPCR仍然保持有限的稀释，允许在6-log的动态范围内进行真正的单分子计数。
此外，Enumerix的独特乳液试剂可将液滴沉淀到PCR管的底部，允许在标准的PCR仪中更有效地加热和冷却。同时，乳液光学透明，使用Enumerix专有的Light Sheet扫描仪可以对PCR管进行3D成像，快速检测DNA阳性液滴。
图3：UltraPCR液滴特征。
UltraPCR方法中，液滴在PCR管内没有相对运动，扩增后可在不到1分钟内直接在PCR管内扫描，处理48个样本的总运行时间为2小时，该工作流程也有助于实现自动化。样本还可以重复存储和重新扫描。在整个单管工作流程中，从形成液滴到成像，UltraPCR混合物都包含在一个封闭系统中，样品之间没有交换，从而显著降低了样品间污染风险。
UltraPCR的DNA计数在单分子方案中通过6-log动态范围使用快速和并行的工作流程进行。即使有100万个DNA拷贝，泊松分布计算出98.34%的阳性液滴只有1个DNA拷贝（图2）。试验中发现，高达130万正RPP30的线性，其中1个阳性液滴转化为1个DNA拷贝，在整个范围内具有一致的∼1%总误差（图4）。
与其他方法相比，增加的液滴数量可以增加检测的动态范围，3000万个液滴还可以消除“多个分子在单个液滴中被放大”的问题。UltraPCR方法的反应死体积为零，装载的样品量是其他技术的4倍，这两者都可以提高灵敏度。这在稀有分子的检测中可能特别重要，例如液体活检。
图4：UltraPCR的6-Log动态范围。
作为概念验证，研究团队展示了基于UltraPCR的NIPT方法，即在单管工作流程中检测13、18和21号染色体上的222个位点，以进行无创胎儿非整倍体检测。在分析染色体比率Chr21/13、Chr21/18和Chr13/18时，研究发现重复之间的总误差较低，为0.319%-0.647%。
研究团队同时使用两条参考染色体（Chr13和Chr18）来评估三体（Chr21）细胞。通过分析，Chr21/13和Chr21/18比值分析在所有%T21条件下均产生了100%的敏感性、特异性和准确性（Chr21/Chr13的阈值为1.054，Chr21/Chr18的阈值为1.066，图5）。
研究团队认为，222- plex UltraPCR可作为一种快速、低成本的筛查方法潜在选择，用于低至4%三体部分样本的无创产前检测，具有高精度、准确性和可重复性。UltraPCR的精度超越了NIPT，可识别qPCR和dPCR目前无法实现的微小基因表达变化。此外，通过对基于UltraPCR的NIPT进一步优化，或可检测性染色体非整倍体和单基因遗传病。
图5：UltraPCR NIPT分析研究。
UltraPCR作为一种创新的dPCR平台，弥补了NGS昂贵且工作流程缓慢与qPCR低成本、速度快但靶标较少之间的差距。UltraPCR可提供超出当前dPCR能力的高分辨率DNA计数，每个阳性液滴都会转化为一个DNA拷贝，从而提供直接的高精度数据，无需纠错，且每个样品的耗材总成本不到10美元。此外，使用222-plex UltraPCR用于无创胎儿非整倍体检测，为临床实验室利用低成本和快速的工作流程取代NGS和芯片检测铺平了道路。Enumerix期望UltraPCR技术能够像NGS一样实现广泛应用。