近日，中山大学附属肿瘤医院张力教授、方文峰教授团队联合裕策生物在Molecular Cancer杂志上发表了首个基于单点取样方法证明中国人群瘤内异质性与免疫治疗相关性的文章。

详情见：Molecular Cancer｜张力教授、方文峰教授团队与裕策生物最新合作研究成果：ITH或将成为肿瘤免疫治疗另一重要标志物

该项研究成果引起了学术界的广泛关注，为了深度解读研究背后的故事，探讨肿瘤精准免疫治疗的临床问题，测序中国邀请了文章的作者和相关领域的临床专家就这个话题开展讨论。

作 者 评 述

第一作者：方文峰 教授（中山大学附属肿瘤医院）

近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）在肿瘤的临床治疗中取得了显著的进展，但是免疫治疗也存在有效人群比例低、耐药、超进展等问题。目前一些常用的生物标志物 PD-L1，TMB，MSI虽然可以在一定程度上预测免疫治疗疗效，但是我们经常在临床上看到PDL1阳性/TMB-H的一部分患者也有很多会出现耐药。免疫耐药的机制是十分复杂的，早在2019年我们团队曾经在Molecular Cancer上发表一项研究是通过多点取样来计算ITH，并提出了ITH是导致EGFR突变患者免疫治疗疗效差的原因，然而ITH多点取样方法可行性较差，临床推广难度也较大，因此我们团队与裕策生物研究团队合作对ITH的算法进行了相关优化，并验证了基于单点取样的ITH在不同癌种中预测免疫治疗疗效的可行性。

研究的主要创新点在于：

1）通过基因的突变频率，拷贝数和杂合性缺失信息，估算出肿瘤中不同突变频率模式的细胞群体，区分出主克隆和亚克隆后计算整体的 ITH，并尝试使用单次取样的整体 ITH 来代表整个肿瘤组织多点取样的 ITH。最终我们验证了ITH分析从多点取样向单点取样的临床可行性，与患者多点取样 ITH 中位值相关系数达 96%。

2）我们研究团队在验证ITH指标预测免疫治疗有效性的过程中使用了来自MSKCC 泛癌种数据集， POPLAR 和 OAK 数据集，这些均是基于 Foundation Medicine 的组织和血液 panel 检测的数据。这也从侧面说明了 ITH 不仅在 WES 检测中有效，也能在 panel 数据中进行预测，实现了高费用WES检测向低费用临床可及性多基因panel检测的转化。

3）实现了组织检测与外周血检测的兼容。液体活检的重要性得到越来越多的认可，尤其是外周血循环肿瘤 DNA（ctDNA），因此我们将ITH在POPLAR 和 OAK 两个免疫治疗队列进行验证后发现ITH可从bTMB-L组有效区分出获益人群 。

4） 我们将ITH 在MSKCC 的泛癌种数据中验证后，发现 ITH分析不仅仅适用于NSCLC，并且适用于多个瘤种，尤其是低TMB人群及TMB预测价值不佳的瘤种，如鼻咽癌、透明肾细胞癌等，具有通用性。

由于目前基于ITH的研究数据均为回顾性数据，且为免疫单药数据，因此在未来希望ITH能够在前瞻性临床研究数据中进行验证。并且随着免疫联合化疗在临床的广泛应用，新的免疫药物越来越多，希望未来能够在化疗联合免疫治疗方案中以及新药研发中进一步评估其价值。

通讯作者：高志博 博士（裕策生物）

裕策团队在肿瘤免疫领域深厚的技术积淀和数据积累，让我们有机会对肿瘤免疫的认知和探索，进入到更高更深的层次。“天梯计划”从一开始就定位非常准确，围绕免疫循环理论，从肿瘤基因组和免疫微环境两个层面推动肿瘤免疫的科学研究和临床转化。ITH是在肿瘤基因组层面，继MSI、TMB、HLA LOH和TNB等之后的另一项重要研究成果，这些检测指标的集成和整合是必然的趋势。

2019年，我们在国内率先提出“肿瘤精准免疫需要综合评估”，这是对单一指标局限性的无奈，更是对免疫治疗复杂性的尊重。裕策生物在2017年发起了“天梯计划”，期望将肿瘤基因组、肿瘤微环境和临床治疗的数据结合起来，目的是加速最新肿瘤免疫疗法的临床转化，其中就包括了免疫治疗biomarker的探索。我们从“天梯计划”数据库中发现了HLA LOH的发生频率很高（约40%），且HLA LOH多属于亚克隆型，表明HLA LOH多发生于肿瘤进展的后期，晚期肿瘤可能选择HLA LOH作为其免疫逃逸的机制。在数据库中我们看到，具有HLA LOH强阳性的，相比非HLA LOH强阳性，DCB在数值上更低（数据较少，不具备统计学意义）；虽然HLA LOH强阳性的患者相比其他患者使用免疫药物的中位OS无显著差异，但所有HLA LOH强阳性的患者均未实现长期获益，其中包括TMB-H的患者。这一结果与近年来发表在Science等文献上的结论是一致的。另外，TNB这个指标我们也是和TMB结合起来提高疗效预测准确性。我们对1,044例临床样本数据分析显示，TMB与TNB的一致性为75%，存在TMB-H但TNB-L等情况，说明这类免疫原性较弱，可能不会从治疗中获益。我们通过对34例使用K药治疗的非小细胞肺癌患者的PFS进行分析，相比仅使用TMB预测药物疗效，TMB/TNB模型提高了近24%的特异性，即可以将部分TMB-H但实际无效患者准确判定为无效患者。

但不论是TMB、HLA LOH、TNB还是ITH，目前都局限在免疫单药中被证明具有疗效预测价值。在新的临床实践环境下，越来越多的免疫（联合）治疗方案选择，对临床医生而言，如何实践精准免疫治疗，需要更有效的临床决策辅助系统。

为了回答这些问题，2020年，裕策进一步强化了免疫微环境的研究能力，布局了一系列国际最前沿的研究技术平台，从DNA到RNA到蛋白，从混合到空间，从单色到多色，全方位提升了最小样本最全信息的检测能力，这些软硬件平台结合前沿的研究设计和临床数据，必定将在免疫微环境领域产生更多重磅的发现。

专 家 点 评

韩为东 教授（解放军总医院第一医学中心）

通过释放体内已有的抗肿瘤T细胞，以及其他类型的免疫细胞的抗肿瘤效应，以PD1等免疫检查点抑制剂为代表的治疗策略已成为近年来抗肿瘤治疗重要的临床突破性疗法。挖掘能够准确预测并判断患者对PD1抗体等药物使用的临床响应率的参数是非常必要的。

体内免疫细胞具有监控肿瘤发生发展的作用，肿瘤演化过程中产生一些抗肿瘤特异的T细胞，抗肿瘤特异T细胞的产生能否跟进肿瘤的演化是目前难以准确回答的一个问题，但我们可以认为肿瘤演化出的异质性越高，体内抗肿瘤T细胞就越是相对不足。肿瘤的异质性，也可以理解为亚克隆的多寡，从某种程度上代表了肿瘤的演化变异程度，肿瘤异质性越高，即亚克隆越多，就预示着体内产生的抗肿瘤特异T细胞越是相对不足，即使使用PD1抗体等把这些细胞的抗肿瘤能力“解放”，也很难获得比较理想的临床响应性或持久响应性。

随着测序技术的不断提升以及对数据分析方法的不断探索性改进，促进了对肿瘤异质性的判断。该文作者通过对69例非小细胞肺癌患者肿瘤组织的全外显子测序产生的数据，综合其中包含的基因突变频率、拷贝数和杂合性缺失信息，估算克隆变异，判断肿瘤异质性高低，进而与PD1抗体临床疗效相关分析，初步证实了该方法可以预测患者临床疗效，并认为该方法的预测准确度可以与肿瘤突变负荷（TMB）的预测度相比拟。将该方法投放到TCGA数据库，在20余种肿瘤中也看到了类似的预测结果。

该研究建立的预测体系对目前采用肿瘤突变负荷预测PD1抗体疗效具有补充作用，两种方法联合判断可能更有助于更合理的临床决策。

宋勇 教授 （南京大学金陵医院）

在该研究中，研究者通过多中心全外显子测序数据，基于突变频率评估肿瘤内异质性（ITH），分析ITH在NSCLC中ICIs治疗的预测作用。文章所呈现的结果表明，ITH独立于TMB，是ICIs疗效的预测标志。单独的ITH-low或TMB-high均提示ICIs治疗良好的临床指标（DCB, ORR和PFS等）。该研究亮点在于，针对TMB-low的群体，ITH的高低也能漂亮的区分疗效优劣，这提示了将ITH与TMB的联合作为免疫治疗biomarker，能推动免疫精准治疗更进一步。

该项研究在外围验证中，将组织ITH的算法拓展至外周血循环肿瘤DNA，尽管其在区分PFS方面的表现不如组织ITH，但研究发现，与组织类似，bTMB-high和ITH-low的组合依旧展现了ICIs治疗最佳临床获益。这为未来无创且动态监测免疫治疗疗效提供新的可能。推而广之，该研究针对泛癌种也做了相应探索，发现在黑色素瘤和膀胱癌中，ITH也具有ICIs治疗的预测性能，甚至在一些TMB不能预测的癌种（黑色素瘤，鼻咽癌及肾癌），ITH也表现良好。

尽管ITH指标为免疫精准治疗提供证据，但也仍然存在一些问题。

首先，ITH-high/low的阈值确定还需要更科学的探索，单中心69例的样本来回答这个问题是远远不够的。

其次，该研究为未来ICIs治疗液体活检提供了一个可能的研究方向，然而外周血循环肿瘤DNA与肿瘤组织存在一定差异，是否将组织ITH的演算直接套用于循环肿瘤标本还有待商榷。

最后，由于OS依旧是评估肿瘤获益的终点指标，单一的ITH指标或ITH/TMB的联合，最终能否预测ICIs治疗患者的总生存，且让我们拭目以待。

黄柳 教授、 褚倩 教授（华中科技大学同济医学院附属同济医院）

（1）研究意义明确，有创新性

“如何实现肿瘤免疫治疗的疗效预测，让免疫治疗的人群更加精准？”，这是免疫治疗时代的一个难题。该研究针对这个难题，做了一系列开创性的探索工作，因此具有很强的代表性。

首先，基于既往的研究基础，通过改进算法，提出了新的ITH评估方法，与传统ITH相比，在保证了准确性（相关系数达 0.96）的前提下，改进了既往多点取材的缺陷，提高了临床应用的便利性，且降低了患者的损伤。

其次，该研究还初步探索了基于外周血循环肿瘤 DNA（ctDNA）的检测平台，来计算ITH的可行性。

最后，该研究还基于泛癌种做了一定的探索，整体而言，发现中位 ITH 水平越低的瘤种，其抗 PD-(L) 1 治疗的有效率越高的显著性趋势，除了非小细胞肺癌，研究者还初步发现在黑色素瘤、食管 / 胃癌、头颈癌和肾癌中，ITH 也可能区分不同疗效的患者群体，而TMB对黑色素瘤，鼻咽癌和肾癌的预测效能是不足的，这为后续开展相关研究提供了参考方向。

（2）研究方法严谨，研究结果有可信度

该研究采用了严格的统计学和生物信息分析方法，并利用多种公共数据库的免疫治疗相关队列，与自身队列相互验证，其研究结果有较好的可信性。

（3）研究结果对临床实践有一定的指导意义，但也提示了预测免疫治疗疗效还比较困难，还需要更进一步的研究。

ITH研究结果告诉我们一些有趣的现象，比方说，ITH-H的非小细胞肺癌患者的免疫治疗疗效差，ITH-L 的患者具有更高的客观缓解率（ORR）和更长的无进展生存期（PFS） (DCB: 45.7% vs 11.8%, p = 0.003; ORR: 31.4% vs 8.8%, p = 0.034; mPFS: 160 vs 60 days, p = 0.0001, HR =2.71)。两者的PFS和ORR有明显差异。但是，单纯依靠ITH-H作为预测指标，只能预测不到50%的有效率，而且PFS 160天（不到半年），似乎还不能完全满足临床的需求，对免疫治疗有效的人群的识别能力，也没有明显优于单用TMB。

在联合TMB以后，研究结果告诉我们，TMB-H& ITH-L的人群和TMB-H& ITH-H的人群的有效率没有差异，但TMB-L & ITH-H的人群有效率为3.2%，似乎可以看出来，增加ITH这个评估指标，能更好的识别免疫无效的患者，也就是有更好的阴性预测价值。

这么看来，我们在免疫治疗的疗效阳性预测方面，仍然是任重而道远的。

（4）该研究提示了后续的研究方向和内容

ITH检测技术和算法的标准化，在不同部位的肿瘤组织中，以及不同种类的种类组织中，是否可以采取统一的检测方法。

ITH的阈值划分还有待进一步的确定。在不同癌症种类的患者中，是否会采用不同的标准？

除了和TMB之外，探索ITH与其他常见的免疫治疗相关 biomarker 之间的优效性比较，或者联合分析比较，以及和免疫通路基因变异之间是否有联合分析应用的价值。

基于ctDNA的ITH计算，研究团队引入了 POPLAR 和 OAK 两个免疫治疗队列的数据。结果发现，在 POPLAR/OAK 的低 ITH 患者生存期有延长的趋势，但未达到统计学意义。这可能和免疫治疗人群基线差异，免疫治疗开始的时机，以及是否联合了其他的治疗方案有关，也可能和ITH的检测时机有关（例如治疗前采血，治疗中采血，治疗后采血等）。虽然基于ctDNA的ITH检测，离临床应用还有距离，还需要进行进一步的验证，但如果以后证实，能用液体活检的方法评估免疫治疗的疗效，就会有更大的临床实用价值。

另外，机制研究方面，本文涉及不多，只是做了新抗原的初步探索，而且多数数据是基于公共数据库的挖掘，还是需要进一步的区分人群特征，进行细化的前瞻性研究。

总之，该研究给我们提供了一个新的探索指标和方向，期待后续前瞻性研究对该标记物的验证结果。

王俊 教授（山东第一医科大学第一附属医院）

现在肿瘤免疫治疗一个很大的热点就是怎样预测这个病人治疗是否有效。在过去我们看到包括PD-L1表达水平、TNB（新生抗原负荷）、CD8+TILs等都可以预测免疫治疗的疗效。从肿瘤内部的biomarker来说，TNB无疑是我们比较认可的biomarker。但是临床上我们也存在一些难点，往往这些biomarker不能够更精准地或者全覆盖预测免疫获益人群，包括近期疗效或者长期生存的一些病人。我们看到张力教授、方文锋教授团队在做的这些工作非常有意义。

我们看到这个工作里面，检测的肿瘤异质性（ITH），是在张力教授之前多点检测的基础上发展的更加简易的一种方法。我认为这个研究本身还是有非常值得肯定的内容：1、使用了单点检测方法；2、利用了外周血进行ITH与免疫疗效相关性分析；3、把ITH这个biomarker扩展到其他的瘤种中进行相关性分析，在NSCLC中TMB-L的患者应用ITH分析预测，并在其他瘤种中也得到同样的趋势，这说明ITH是个泛瘤种的biomarker，具有广谱性；4、该研究不仅应用了中山肿瘤医院的一个队列研究，还应用了天梯的队列，以及其他瘤种的队列。从训练队列和其他队列里面都得到一致的结果。当然，我们也期待在这个研究的基础上做一些更深入的探索。

该研究有几个方面值得借鉴，第一：该研究是基于回顾性队列，我们也希望将来进行前瞻性研究或者纳入这些病人进一步分析ITH的预测价值；第二：我们看到外周血的ITH的分析，是基于POPLAR和OAK 的数据，期待这个研究有中国人的样本资料；第三：我们基于TNB、TMB，又或者是ITH预测免疫疗效，但都是基于肿瘤本身。我们想综合预测的biomarker应该是更广泛的，应该包括肿瘤免疫微环境、抗原呈递等。是否可以把ITH、PD-L1水平的表达、肿瘤淋巴细胞浸润等整合为一个联合biomarker进行预测？是我们将来需要做的内容。

吴育锋 教授 （河南省肿瘤医院）

近年来，以PD-1/PD-L1为代表的免疫治疗药物的应用以及呈现出的突出疗效，使晚期肺癌患者的5年生存率首次提高到了16%，相比4.7%提高了近3倍。然而，仅有约20%的肺癌患者对免疫治疗有效，如何筛选适宜人群是目前重点研究工作。

一般来说，高TMB的肿瘤因较多的新生抗原而更易产生免疫反应。然而，很多低TMB的患者依然可从免疫治疗中获益，故仅仅依靠TMB并不能准确预测免疫治疗的疗效。急需合适且确切的预测指标来指导临床。张力教授和方文峰教授团队联合裕策生物所进行的这项研究着眼于通过肿瘤异质性（ITH）结合TMB对免疫治疗进行预测，具有非常重要的意义。

肿瘤异质性（ITH）是恶性肿瘤的一个特征，药物治疗只能清除那些敏感的细胞亚群，这也是肿瘤容易耐药复发的原因。过去计算ITH一般需要检测完整肿瘤组织，多点多部位取样理论可行，但实际操作困难。该研究基于新算法计算的整体单次取样 ITH与患者多点取样 ITH 中位值高度相关，在很大程度上可代表多点取样的 ITH，使ITH具备实际临床应用和推广的可行性。基于此进行的69例二线接受PD-(L)1 单抗单药治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）队列进行研究，证实了ITH的免疫治疗疗效预测能力。并在 Miao 的多癌种数据集和 Anagnostou 肺癌数据集里面证实ITH单独或联合 TMB 后，均可显示较好的预测价值。以及在POPLAR 和 OAK 两个免疫治疗队列中证实ITH 的预测效果可适用于 ctDNA 数据，进一步扩大了ITH的适用性。并通过 TCGA 数据库，发现在 20 多个癌种的PD-(L) 1 治疗中，越低的ITH可能有越高的有效率，证实ITH适用于泛癌种。除TMB外，ITH联合PD-L1表达水平、MSI、TNB等其他疗效预测标志物亦可能显示较好的预测能力，仍需后期的研究来证实。

该研究证实了ITH的免疫治疗疗效预测价值以及提高了临床ITH检测的可及性，较好的解决临床的关切点，有望实现预测免疫治疗疗效的预测。

姜丽岩 （上海交通大学附属胸科医院）

这项研究看了以后让人眼前一亮，他的理论基础是基于2019年发表在Cell上的一项研究结果——在黑色素瘤中的ITH越高，免疫系统被抑制的程度越高，癌症进展更快，免疫治疗效果越差。研究团队首先对ITH这个biomarker在非小细胞肺癌免疫治疗中的应用展开探索。在研究方法方面，之前张力教授团队在非小细胞肺癌所做的多点取样，综合评估各个取样位点的基因突变情况，进而计算出患者整体的 ITH 程度。这个研究则是在此基础上开展，并对ITH的算法进行了优化，优化后的 ITH 算法成功实现单点取样即可估算患者的整体 ITH 程度，这种研究方法本身就是一个很有价值的创新。那ITH能不能跟免疫治疗的疗效相关？从该研究当中，我们看到回顾性的数据得到了非常好的证实。

此外，该研究还运用了POPLAR/OAK的数据，对血液样本的ITH进行检测，虽然最终从统计学意义上没达到，但是我们能看到血液当中检测的ITH有疗效预测效能的一个趋势。另外，该研究还在泛瘤种以及不同的检测方式（大panel和WES的检测）做了比较。综合来讲这项研究的内容是十分丰富的，对我们将来在临床上使用这个指标是有指导意义的。

我对该研究有几点期望：一是该项研究是一个回顾性的研究，希望将来能运用这个指标和现有的免疫评估的biomarker结合起来分析，做一些前瞻性研究，这样的结果是我们更加期待的。二是在分析ITH这个指标的时候我们注意到有一些样本分布的离散性较大，那么如何正确解释这些离散的样本，或者说在未来的研究当中，在更大样本当中，能否重复出来现有的结果，是我们需要注意的一个点。

结 语

肿瘤免疫治疗起效的核心之一是具有免疫原性的新生抗原被识别和呈递，进而激活T细胞的抗肿瘤反应，TMB可以理解为对肿瘤新生抗原数量的描述，而ITH则是新生抗原质量的描述。然而抗肿瘤免疫循环涉及七大步骤，精准免疫检测实质就是探索每一位患者的免疫逃逸机制，从而指导合理的（联合）治疗方案使抗肿瘤免疫反应恢复正常化。单一指标的检测无异于盲人摸象、管中窥豹，不仅难以全面评估患者治疗前的机体免疫与肿瘤进化状态，更加无法解释耐药发生的机制。

裕策生物作为国内较早从事肿瘤免疫诊疗的基因检测公司，现已建成国内领先的多维组学平台，从“时”、“空”两个维度开展科研探索，转化临床产品，致力于实现“让肿瘤免疫更有效”的使命。