目的： 通过移植瘤动物实验探讨奥希替尼泰瑞沙AZD9291联合抗VEGF单克隆抗体靶向药物贝伐珠单抗的疗效及作用机制，为进一步临床试验提供理论依据。
方法：构建EGFR T790M突变的H1975人肺腺癌细胞移植瘤动物模型。
实验分组：低剂量奥希替尼组、高剂量奥希替尼组、低剂量奥希替尼联合贝伐珠单抗组、高剂量奥希替尼联合贝伐珠单抗组。每组各5只小鼠，给药方法：奥希替尼2.5 mg/kg/d或5 mg/kg/d，采用每天灌胃处理；贝伐珠单抗5 mg/kg，每周2次腹腔注射。接种后和给药期间绘制肿瘤生长曲线，给药2周后处死裸鼠，活检整个肿瘤。免疫组织化学SP法检测肿瘤HIF-1α、VEGF和微血管密度（microvessel density，MVD）。应用Western blot法检测EGFR及其下游AKT和ERK信号通路蛋白的表达。
结果：给药2周后，高剂量奥希替尼单药组较低剂量奥希替尼单药组肿瘤体积明显缩小，HIF-1α、VEGF 表达率和MVD 显著降低（P<0.05），p-EGFR、p-AKT 和p-ERK 表达减少（P<0.05）。低剂量奥希替尼联合贝伐珠单抗组肿瘤体积明显小于低剂量奥希替尼单药组（P<0.05），上述因子均明显降低（P<0.05）。低剂量奥希替尼联合组与高剂量奥希替尼单药组比较，肿瘤体积差异无统计学意义（P=0.178），p-EGFR、p-AKT、p-ERK表达差异无统计学意义（P>0.05）。高剂量奥希替尼联合组与高剂量奥希替尼单药组体积差异无统计学意义（P=0.642）。两个联合组之间，体积差异均无统计学意义（P=0.072），上述因子表达差异均无统计学意义（P>0.05）。
结论：贝伐珠单抗能够显著增加奥希替尼对伴EGFR T790M突变的肺腺癌移植瘤的杀伤能力。贝伐珠单抗与奥希替尼协同作用是通过降低肿瘤中VEGF表达，改善肿瘤微环境，增强抑制EGFR下游信号通路激活而实现的。
关键词：非小细胞肺癌 表皮生长因子受体 酪氨酸激酶抑制剂 抗血管生成治疗 肿瘤微环境
肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，其中85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］。化疗联合抗血管生成靶向药物可显著延长非鳞型NSCLC患者总生存期（overall survival，OS）［2-5］。近年来，个体化分子靶向治疗取得了巨大成功。对于EGFR敏感突变的NSCLC（外显子19缺失［E19 del］和外显子21点突变［E21 L858R］），采用第一代或第二代EGFR-TKIs治疗，相比于传统化疗可明显改善患者的预后。
AURA-3 Ⅲ期临床研究显示，既往使用EGFR-TKIs进展且存在T790M获得性突变的患者，奥希替尼的客观缓解率（objective response rate，ORR）高达71%，中位无进展生存期（median progression free survival，mPFS）10.1个月［6］。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）在血管发生中发挥重要作用，是肿瘤中内皮细胞存活所必需的。贝伐珠单抗能够降低VEGF水平阻断新生血管生成，瞬时正常化肿瘤迂曲的血管，改善肿瘤氧合并减少间质液压力，以及恢复药物到肿瘤中的递送，这可能使肿瘤细胞对EGFRTKIs更敏感。JO25567Ⅱ期临床试验显示，厄洛替尼联合贝伐珠单抗较单药厄洛替尼可显著延长EGFR敏感突变NSCLC 患者的mPFS（16 个月vs. 9.7 个月），相比单纯EGFR敏感突变患者而言，EGFR敏感突变合并T790M突变肺癌采用厄洛替尼联合贝伐珠单抗一线治疗PFS明显延长（16个月vs. 10.5个月）［7］。
本研究通过构建T790M突变裸鼠肺癌移植瘤模型，采用奥希替尼联合或不联合贝伐珠单抗干预，探讨肿瘤微环境的改变对第三代EGFR-TKI 治疗T790M突变肺癌的影响及相关分子机制，为进一步临床试验提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂和材料
人肺腺癌细胞系H1975（EGFR E20 T790M）细胞株由四川大学华西医院馈赠。实验动物为SPF级雌性裸鼠BALB/C裸鼠20只（4～6周龄，20 g左右），购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证编号SCXK（京）2014-0004。实验获医院动物保护和应用委员会批准。
奥希替尼（AZD9291）购自美国Selleck公司；贝伐珠单抗购自瑞士罗氏公司，ECL Plus发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。免疫组织化学SP超敏试剂盒、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。CD34、VEGFA、HIF-1α抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。EGFR、AKT、ERK及p-EGFR、p-AKT、p-ERK购于美国Santa Cruz公司，GAPDH抗体购自美国Proteintech公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及裸鼠移植瘤模型建立
H1975细胞培养于RPMI 1640 培养基中（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素），于37℃，5%CO2，90%湿度孵箱中培养，细胞贴壁。取对数生长期细胞，消化计数，2×106/mL细胞/只接种于小鼠右后肢前方的侧腹壁皮下。约1周后开始成瘤，接种后和给药期间每周测量肿瘤体积至少2次。
在小鼠肿瘤长至平均为0.2～0.4 cm3时随机分4组：A组（Low-O）：低剂量奥希替尼组（n=5，2.5mg/kg/d）；B组（High-O）：高剂量奥希替尼组（n=5，5 mg/kg/d）；C组（Low-OB）：奥希替尼低剂量联合贝伐珠单抗给药组（n=5，奥体替尼2.5 mg/kg/d，贝伐珠单抗5 mg/kg，每周2次）；D组（High-OB）：奥希替尼高剂量联合贝伐珠单抗给药组（n=5，奥体替尼5 mg/kg/d，贝伐珠单抗5 mg/kg，每周2次）。当肿瘤平均体积达到0.4～0.6 cm3（肿瘤体积V=L×W2×π/6）时开始药物干预。给药方法：奥希替尼采用每天灌胃处理，贝伐珠单抗每周2次腹腔注射。接种后和给药期间绘制肿瘤生长曲线，给药2周后处死裸鼠，活检整个肿瘤切取部分置于4%多聚甲醛溶液中，剩余冻存于液氮中。
1.2.2 免疫组织化学检测和判定标准
活检组织于4%多聚甲醛溶液固定48 h后，常规脱水、石蜡包埋、切片，一抗采用兔抗鼠CD34、VEGFA、HIF-1α单克隆抗体，SP法免疫组织化学染色、最后DAB显色，苏木精复染，封片。常规光镜观察表达情况，每张切片随机选取至少5个400倍视野，采用染色阳性细胞和染色强度双评法［8-9］。未见阳性细胞者评分0分，阳性细胞比例≤10%者评定为1分，阳性细胞比例11%～50%者评定为2分，阳性细胞比例51%～80%者评定为3分，阳性细胞比例>80%者评定为3分；不显色或显色模糊者评定为0分，浅黄色者评定为1分，棕黄色者评定为2分，棕褐色者评定为3分。最终结果判定采用两项相加：3分为弱阳性，4～5分为中度阳性，6～7分为强阳性，当阳性细胞比例<10%，不管显色程度，均判为阴性。微血管密度（microvessel density，MVD）阳性判定：每张切片在100×倍镜下找到3个染色血管最密集的区域，称为热点区域，在200倍镜下计数热点区域血管。每1个染成棕色，可与周围血管、肿瘤细胞和其他肿瘤间质分开的内皮细胞或内皮细胞簇，均可作为单一计数的微血管。3个区域的均值为肿瘤的MVD值。
1.2.3 Western blot法检测
分别将各组移植瘤标本在冰水浴中匀浆后裂解（加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度，5×上样缓冲液混匀，煮沸3 min，迅速冰浴中冷却，上样量为每泳道30 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜至PVDF膜，小牛血清蛋白封闭2 h，加入相应一抗4℃过夜孵育（GAPDH为内参）。洗涤后用二抗孵育，化学发光显色，用image J分析各目的蛋白灰度值检测及分析。
1.3 统计学分析
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据采用x ± s 表示。各组肿瘤体积、各样本灰度值、MVD、VEGF、HIF-1α表达比较均采用t 检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 移植瘤裸鼠肿瘤生长情况
实验期间A、C、D组各有1只裸鼠死亡，其余裸鼠一般状况良好，裸鼠移植瘤情况（图1），各组移植瘤生长曲线（图2），切除后各组移植瘤（图3）。各处理组移植瘤裸鼠给药前和处死后肿瘤体积变化情况（表1）。肿瘤细胞接种2.5周时（给药前）各处理组之间肿瘤体积差异无统计学意义（P>0.05）。给药2周后，奥希替尼联合贝伐珠单抗给药两组肿瘤体积均显著小于低剂量奥希替尼单药组（P<0.05），低剂量奥希替尼联合组与高剂量奥希替尼单药组肿瘤体积差异不明显（P=0.178）。高剂量奥希替尼联合组与高剂量奥希替尼单药组体积差异无显著性（P=0.642）。两联合组间体积差异无显著性（P=0.072）。
2.2 移植瘤裸鼠肿瘤组织中VEGF、HIF蛋白表达及MVD免疫组织化学结果显示，VEGF表达在肿瘤细胞的胞质或胞膜，而HIF-1α表达在胞核（图4，5）。奥希替尼联合贝伐珠单抗给药组VEGF和HIF-1α表达率较单药组低（P<0.01）；两联合组之间VEGF 和HIF-1α表达率差异无统计学意义（P=0.348，0.830）；高剂量奥希替尼单药组VEGF和HIF-1α表达率较低剂量奥希替尼单药组低（P=0.012，0.008）。
联合贝伐珠单抗给药组MVD 较单药组低（P<0.05），两联合组MVD表达率差异无统计学意义（P=0.453）；奥希替尼AZD9291单药处理两组中，高剂量单药组较低剂量单药组MVD低（P=0.026）。
2.3 各组EGFR及其下游AKT和ERK通路蛋白表达
应用Western blot法检测各处理组蛋白结果（图阳性细胞比例51%～80%者评定为3分，阳性细胞比例>80%者评定为3分；不显色或显色模糊者评定为0分，浅黄色者评定为1分，棕黄色者评定为2分，棕褐色者评定为3分。最终结果判定采用两项相加：3分为弱阳性，4～5分为中度阳性，6～7分为强阳性，当阳性细胞比例<10%，不管显色程度，均判为阴性。微血管密度（microvessel density，MVD）阳性判定：每张切片在100×倍镜下找到3个染色血管最密集的区域，称为热点区域，在200倍镜下计数热点区域血管。每1个染成棕色，可与周围血管、肿瘤细胞和其他肿瘤间质分开的内皮细胞或内皮细胞簇，均可作为单一计数的微血管。3个区域的均值为肿瘤的MVD值。
1.2.3 Western blot法检测分别将各组移植瘤标本
在冰水浴中匀浆后裂解（加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度，5×上样缓冲液混匀，煮沸3 min，迅速冰浴中冷却，上样量为每泳道30 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜至PVDF膜，小牛血清蛋白封闭2 h，加入相应一抗4℃过夜孵育（GAPDH为内参）。洗涤后用二抗孵育，化学发光显色，用image J分析各目的蛋白灰度值检测及分析。
1.3 统计学分析
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据采用x ± s 表示。各组肿瘤体积、各样本灰度值、MVD、VEGF、HIF-1α表达比较均采用t 检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 移植瘤裸鼠肿瘤生长情况
实验期间A、C、D组各有1只裸鼠死亡，其余裸鼠一般状况良好，裸鼠移植瘤情况（图1），各组移植瘤生长曲线（图2），切除后各组移植瘤（图3）。
各处理组移植瘤裸鼠给药前和处死后肿瘤体积变化情况（表1）。肿瘤细胞接种2.5周时（给药前）各处理组之间肿瘤体积差异无统计学意义（P>0.05）。给药2周后，奥希替尼联合贝伐珠单抗给药两组肿瘤体积均显著小于低剂量奥希替尼单药组（P<0.05），低剂量奥希替尼联合组与高剂量奥希替尼单药组肿瘤体积差异不明显（P=0.178）。高剂量奥希替尼联合组与高剂量奥希替尼单药组体积差异无显著性（P=0.642）。两联合组间体积差异无显著性（P=0.072）。
▶A. Low-dose osimertinib group; B. High-dose osimertinibgroup; C. Low- dose osimertinib plus bevacizumabgroup; D. High-dose osimertinib plus bevacizumab group图1 各处理组给药2周后移植瘤图6）。高剂量奥希替尼单药组相比低剂量奥希替尼AZD9291组p-EGFR、p-AKT 和p-ERK 蛋白表达明显降低（P<0.05）；奥希替尼联合贝伐珠单抗给药组p-EGFR、p-AKT和p-ERK表达较奥希替尼AZD9291单药组明显降低（P<0.05）；p-EGFR、p-AKT和p-ERK表达差异无统计学意义（P=0.089，0.381，0.590）；两联合给药组之间p-EGFR、p-AKT、p-ERK蛋白表达差异无统计学意义（P=0.216，0.178，0.076）。EGFR、AKT、ERK在各处理组中表达差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
有研究提示，EGFR-TKIs 获得性耐药后肿瘤VEGF水平会升高，提出耐药后肿瘤细胞对EGFR信号通路的依赖性会降低，而对VEGF 通路的依赖提高［10］。本研究显示，EGFR信号通路依然是T790M耐药突变肺癌细胞重要的生长依赖信号通路，奥希替尼AZD9291对EGFR 及其下游PI3K/AKT/mTOR 和Ras-Raf-MAPK信号通路均有抑制作用，联合贝伐珠单抗改善了肿瘤组织内的微环境，增强了这两条信号通路的抑制作用，从而更有效地杀伤肿瘤细胞。
EGFR与VEGF相关信号通路均在肿瘤发生发展过程中发挥至关重要的作用。EGFR的异常激活导致肿瘤增殖加速且不受调控，VEGF信号通路与肿瘤血管生成相关。Folkman等［11］提出肿瘤血管生成依赖于激活“血管生成开关”，VEGFA是VEGF最常见的亚型，与VEGFR1，VEGFR2，NRPs（神经素）结合后，触发并激活下游信号通路，促进血管内皮增殖与迁移。VEGF也可引起微血管通透性升高，还可使循环内皮细胞前体、相关免疫细胞和间充质细胞聚集，在构建肿瘤微环境中发挥重要作用。Lichtenberger等［12］研究显示，EGFR通路与VEGF通路存在“cross⁃talk”效应，两者具有协同促进肿瘤生长的作用。
本研究观察到，随着奥希替尼AZD9291给药剂量的增加，药物抑瘤效果增强，而联合VEGF抗体后，奥希替尼抑瘤作用也会增强。而从肿瘤生长曲线可以观察到，贝伐珠单抗协同抑瘤作用较单药剂量加倍抑瘤作用更显著。提示适当剂量的奥希替尼联合抗血管治疗或许比单纯增加奥希替尼剂量能带来更大获益。另一方面，这种联合作用可以降低因为单一增加药物剂量所造成的剂量限制性毒性，当然联合贝伐珠单抗也会引起高血压和出血等风险的增加。在实验中，两联合组各有1只小鼠死亡。需要注意的是，与低剂量奥希替尼组小鼠在实验后期因为肿瘤负荷大所导致的死亡不同，联合组小鼠死亡发生在贝伐珠单抗给药后第3 d，不能确定是由于药物本身引起还是由于实验操作所导致。
本实验中还观察到，奥希替尼AZD9291联合贝伐珠单抗组VEGF表达与微血管密度较奥希替尼单药组减少，但奥希替尼联合贝伐珠单抗组并未因为微血管密度降低而高表达HIF-1α。研究表明，HIF-1α能够增强肿瘤细胞上皮间质转化作用，重构细胞外基质，诱导耐药，而且能够增强肿瘤干细胞活性，协助肿瘤细胞免疫逃逸的产生。本研究认为虽然贝伐珠单抗抑制了肿瘤新生血管生成，但却改善了肿瘤内环境，进而改善了肿瘤组织内的供氧。这也符合Jain等［13］提出的在抗血管生成治疗中出现的血管正常化现象：在1周以内，抗血管生成治疗能使迂曲变形的血管变得更加正常，组织含氧量增加。但治疗持续2.5周，远超血管正常化的时间窗。Foster 等［14］认为，HIF-1αmRNA与蛋白合成并不仅仅依赖于氧，很大程度上依赖PI3K和MAPK通路。而高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐珠单抗治疗组PI3K和MAPK信号通路被抑制，所以HIF-1α表达下降是可以解释的。
观察到奥希替尼AZD9291作用后能够降低下游活化的p-EGFR表达，影响PI3K/AKT/mTOR和Ras-Raf-MAPK双信号通路。这与既往Cross等［15］在体内外实验中对单药奥希替尼作用机制的研究发现相一致。联合贝伐珠单抗加强了这2条信号通路的抑制作用，这也从分子机制上解释了联合治疗为什么能够带来更多的肿瘤缩小。
综上所述，本研究通过移植瘤动物实验证实，第3代EGFR-TKI奥希替尼AZD9291对伴EGFR T790M突变的肺腺癌移植瘤具有很强的抑瘤作用，而贝伐珠单抗能够显著增加奥希替尼对伴EGFR T790M突变的肺腺癌移植瘤的杀伤能力，两者具有协同作用。贝伐珠单抗与奥希替尼协同作用是通过降低肿瘤中VEGF表达，改善肿瘤微环境，增强抑制EGFR下游信号通路激活而实现的。本研究为进一步临床试验提供理论依据。
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