▉ 前言

ADC【（antibody-drug conjugate）🔗点此复习】由抗体、效应分子和连接子三个部分组成。每一部分对ADC的作用都至关重要，但今天我们把目光放在连接抗体和效应分子的连接子上，看看过去5年来，人们对连接子的探索到了何种程度。

对ADC来说，连接子需要承担的任务有两个：第一，它要保证ADC在血液中有较好的稳定性；第二，它要保证ADC能精准地将效应分子在目标位置释放。

连接子在其发展过程中碰到了许多问题，大致有如下几点：

1）无法精准地在肿瘤区域释放效应分子而不在正常组织释放。例如辉瑞的Mylotarg，就是因为连接子不能区域选择性地释放效应分子而导致脱靶毒性，在2010年Mylotarg因肝毒性而撤市，虽然2017年又恢复了上市，但FDA对它打上了黑匣子的标签；

2）丁二酰亚胺连接子发生retro-Michael-addition反应而影响ADC效果。最典型的例子就是琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-甲酸酯连接子（SMCC连接子），这种连接子在血浆中120h后将只剩下38%；

3）连接子与效应分子的连接方式很欠缺。随着人们对ADC的研究越来越多，效应分子的种类也急剧增加，但连接子的种类相对还是比较少，无法跟上效应分子的开发速度。

本文将分两篇从四个方面介绍连接子的最新进展，上篇是连接子的断裂位点、下篇是连接子与抗体的连接方式、连接子与效应分子的连接方式、连接子的ADME特性。

▉ 连接子的断裂位点

连接子的断裂直接控制着效应分子的释放，要想减少ADC的脱靶毒性，就必须设计出具有选择性的断裂位点。

1.1 组蛋白酶解位点

Val-Cit连接子是个典型的例子，这种连接子可被多种组蛋白酶（B、K、L等）水解，导致采用这种连接子的ADC会产生很大的毒性，因为除了组蛋白酶B在肿瘤细胞特异性高表达，其他组蛋白酶在正常细胞也有较高表达。后来将缬氨酸的异丙基替换成四元环后（称cBu-Cit连接子），连接子就只对组蛋白酶B敏感了，大大提高了选择性，与此同时还依旧保持与Val-Cit连接子一致的活性

Val-Cit连接子和cBu-Cit连接子

但是有研究表明，含有缬氨酸（Val）的连接子容易被小鼠血浆中的羧酸酯酶1C（Ces1C）水解，为了解决这一问题，人们又发明了CX连接子。CX连接子由三个甘氨酸构成（图2），在小鼠血浆中具有较好的稳定性，与SMCC连接子相当，同时比SMCC具有更高的体内外活性。

CX连接子

1.2 酸解位点

肿瘤区域的pH值一般在4.0-5.0，而血浆的pH值约为7.4，酸敏连接子就是通过这种差异来发挥作用。Mylotarg和Trodelvy采用的就是这种策略，但它们的稳定性并不是很好，二者在血浆中的半衰期分别是48h和36h。为了解决这一问题，硅脂结构的连接子出现了，它大大增加了ADC的稳定性，血浆半衰期提高到1周以上。

传统的酸敏连接子和硅脂连接子

1.3 GSH断裂位点

胞浆中的谷胱甘肽（GSH）浓度（1-10mmol/L）远高于血浆中的浓度（约5μmol/L），而GSH可以水解二硫键，因此二硫键是一种可能的策略，但二硫键在血浆中的稳定性并不好。为了解决这一问题，人们通过基因工程技术将抗体的特定部位改为半胱氨酸，然后将效应分子通过半胱氨酸直接连接到抗体上，这样二硫键在抗体位阻的保护下降低了水解活性，大大增加了ADC的血浆半衰期。

以上方法仅适用于含有巯基的效应分子，为了扩展到其他效应分子（如MMAE），人们在效应分子前增加了一个带有巯基的连接子——disulfide-carbamate连接子。

图4 GSH断裂位点（A为DM通过二硫键直接连接到抗体，以及MMAE通过disulfide-carbamate连接子连接到抗体，B为PBD二聚体通过disulfide-carbamate连接子连接到抗体）

1.4 二价铁断裂位点

由于肿瘤细胞铁元素的异常代谢会导致游离Fe2+的浓度升高，因此这种特性可以作为ADC连接子的设计策略。TRX连接子是一种对Fe2+敏感的连接子，氧杂环在Fe2+的作用下断裂形成羰基，然后通过β-消除反应释放出效应分子MMAE。但这种连接子仍具有一定毒性，这是由于金刚烷与抗体产生位阻，导致氧杂环容易断裂。为了解决这一问题，人们试图在金刚烷与抗体之间插入PEG链来增加二者的空间距离，以减少位阻导致的副作用。

TRX连接子及其断裂机制

1.5 新型酶解位点

除了组蛋白酶，还有许多其他种类的酶用于ADC连接子的设计。β-葡萄糖苷酸酶是最早的一个 （下图B） ，后来人们还发现了β-半乳糖苷酶也在肿瘤细胞中过表达，并且具有水解活性。于是含有半乳糖苷的连接子出现了 （下图A） ，这种连接子与葡萄糖苷连接子的活性在体内外都表现相当，并且与Val-Cit连接子相比，其体内外毒性都更低。

β-半乳糖连接子及其水解机制（A）和硫酸连接子水解机制（C）

硫酸酯酶也在肿瘤细胞中过表达，它是β-半乳糖苷酶的同源蛋白。与糖苷连接子类似，硫酸连接子中的硫酸被酶水解后，就会释放出效应分子（上图C）。与Val-Ala连接子和Val-Cit连接子相比（半衰期1h），硫酸连接子的血浆稳定性大大提升（半衰期1周以上），但体外毒性有所增加。

磷酸酯和焦磷酸酯可提高连接子的水溶性，可用于携带脂溶性较高的效应分子。起初，为了提高水溶性，人们直接在Val-Cit-PAB连接子后加了焦磷酸酯基团，但稳定性太低（血浆半衰期只有不到6h），这是因为两个位点都可以被水解 (下图A)。后来将Val-Cit-PAB替换为焦磷酸酯连接子（下图B），血浆稳定性大大提高（半衰期1周以上），并且仍然具有较好的水解活性，同时又增加了ADC的水溶性，减少了高脂溶性效应分子的聚集。

焦磷酸酯连接子

1.6 光敏位点

顾名思义，光敏位点可以在特定波长的光照下发生裂解，从而释放出效应分子。相比普通的连接子，光敏连接子往往可控性较高，减少脱靶毒性，并且有明确的断裂机制，此外，其在细胞内的药物释放不会受各种因素的限制（如酶、pH）。

下图A是一种对近红外敏感的连接子，在650-900nm波长照射下可释放出效应分子CA-4。但这种连接子有一定聚集性以及光不稳定性，因此限制了它的使用。下图B是一种对紫外敏感的连接子，这种连接子在自然光下几乎不释放毒性分子，但在365nm波长光照下即可立马释放，在体内实验中，该连接子表现出更长的半衰期，与单独的抗体相当。

近红外敏感连接子（A）和紫外敏感连接子（B和C）

PC4AP（上图C）是另一种对紫外敏感的连接子，这种连接子含有两处相同的断裂位点，当收到365nm波长光照后，首先脱去两个Nv基团，随后抗体上临近的赖氨酸与PC4AP发生分子内加成反应，最终通过消除一份子CO2释放出效应分子。这种连接子在自然光下毒性很小，并且在紫外下的毒力与纯粹的效应分子相当。

尽管如此，光敏连接子还是有它自身的缺陷。对红外敏感的连接子往往具有复杂的结构、自身聚集性、光不稳定性，以及较差的体外药代动力学性质。而对紫外敏感的连接子，其最大的缺陷就是，紫外光本身就会对机体产生较大的伤害，并且紫外光对机体组织的穿透能力较差，无法到达较深的部位。

1.7 不可裂连接子

还有一类连接子不含有化学敏感的位点，称不可裂连接子。SMCC是个经典的例子，但这种连接子稳定性较差，并且水溶性不够好。后来在此基础上，人们将SMCC替换为MD连接子（将环己烷替换为1,3-二氧六环），提高了水溶性和稳定性。

SMCC连接子和MD连接子

还有一种不可裂连接子用于PBD毒性分子，这种连接子如下图所示，它们都包含一条PEG链，苯环用于连接两个PBD分子，只有连接PEG和苯环的部分有所差别，但体内外活性表明只有炔和哌啶的结构效果较好，而三唑环的效果并不理想。

含PEG链的连接子

参考文献：

1.Antibody–drug conjugates: Recent advances in linkerchemistry

https://doi.org/10.1016/j.apsb.2021.03.042

2.Chu Y, Zhou X, Wang X. Antibody-drug conjugates for the treatment of lymphoma: clinical advances and latest progress. J Hematol Oncol. 2021 Jun 5;14(1):88. doi: 10.1186/s13045-021-01097-z.