1 北京大学深圳医院， 深圳北京大学香港科技大学医学中心
2 北京大学基础医学院病原生物学系暨感染病中心
1 血清HBV RNA的存在形式和来源
1996年，德国学者Köck等在HBV感染者血清中首次发现HBV RNA的存在，后续相继开展了临床意义探索研究。
2016年，笔者团队和其他课题组先后系统地证实血清中的HBV RNA为未经或部分逆转录的、存在于核衣壳内的前基因组RNA（pgRNA），来自于感染肝细胞内共价闭合环状DNA（cccDNA）的转录。随后，其他研究团队也得出相似的研究结果。虽然关于血清中的HBV RNA是否主要存在于带有病毒包膜的病毒样颗粒内仍存不同观点，但均一致认为血清HBV RNA主要存在于病毒核衣壳内，这一特性使其能相对稳定地存在于血液中。
慢性乙型肝炎（CHB）患者接受核苷（酸）类药物（NAs）治疗后，可有效阻断HBV松弛环状DNA（rcDNA）的合成，在短期内可导致循环血中未经或部分逆转录的pgRNA水平增加；但在长期的NAs治疗下，伴随着肝细胞内cccDNA减少，细胞内外的HBV RNA水平随之下降。HBV pgRNA存在不同长度的剪切变异体，但其存在的意义尚未完全阐明。NAs治疗除了可使异常的剪接变异体增加外，也可导致细胞内外出现大量pgRNA 3′末端截短体，致使血清中的HBV RNA病毒样颗粒复制缺陷，使其缺乏感染能力。
2 影响血清HBV RNA水平的因素
一般而言，CHB患者血清中的HBV RNA低于HBV DNA水平。Butler等研究发现，HBsAg阳性的献血者中血清HBV RNA水平约为HBV DNA水平的1/100。多项研究证实，处于不同自然史阶段的慢性HBV感染者其血清HBV RNA的水平存在明显差异。
Wang等将102例慢性HBV感染者根据临床自然史分为4期：免疫耐受期HBV RNA水平最高，均值为6.78 log10 拷贝/ml，其次是免疫清除期5.73 log10 拷贝/ml，再活动期4.52 log10 拷贝/ml和低病毒复制期2.96 log10 拷贝/ml。
van Campenhout等检测了488例慢性HBV感染者血清HBV RNA水平，这些患者的HBV基因型的分布分别为A基因型21%、B基因型10%、C基因型20%、D基因型46%和其他基因型3%。其中HBeAg阳性患者血清HBV RNA平均水平（6.5 log10 拷贝/ml）显著高于HBeAg阴性患者（4.1 log10 拷贝/ml），相对于D基因型而言，A、B和C 基因型的HBV RNA水平较低。此外，该研究还发现低水平的HBV RNA与HBV基因组存在基本核心启动子突变或者前C区联合突变有关，并且血清HBV RNA水平与ALT水平呈正相关。
由此可见，血清HBV RNA的水平在不同疾病进展阶段的CHB患者中存在差异，在应用血清HBV RNA这一指标时应考虑以上影响因素，并与其他病毒学指标和生化指标联合应用，以准确判断病毒的复制情况和疾病进展。
3 血清HBV RNA与其他的病毒血清学指标的相关性
血清HBV RNA作为新的病毒学指标，需要进一步了解其与传统指标间的关系，以利于其在临床实践中的应用。多项研究证实，血清中的HBV RNA与肝组织中的pgRNA高度相关，这在一定程度上也进一步证明了其来源于cccDNA的转录。此外，在不同基因型的HBV中，血清HBV RNA与血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg均具有相关性。
笔者团队前期对84例非经治的慢性HBV感染者进行的研究也发现，血清HBV RNA水平分别与血清HBV DNA（r=0.574，P＜0.001）和HBsAg（r=0.545，P＜0.001）呈正相关。进一步将上述慢性HBV感染者分为HBeAg阳性和HBeAg阴性两组，在HBeAg阳性者中血清HBV RNA仍分别与血清HBV DNA（r=0.532，P＜0.001）和HBsAg（r=0.537，P＜0.001）呈正相关，但在HBeAg阴性者中，血清HBV RNA仅与血清HBV DNA呈正相关（r=0.741，P＜0.001），而与血清HBsAg无相关性（r=0.151，P=0.503）。由此可见，HBeAg阳性CHB患者血清HBV RNA与其他的病毒血清学指标的相关性优于HBeAg阴性患者。
Butler等发现，在接受NAs治疗的CHB患者中，血清HBV RNA水平与HBV DNA水平的相关性较低。笔者的研究也发现CHB患者在接受NAs治疗后血清HBV DNA常常低于检测下限，而大部分患者血清HBV RNA仍可被检测，二者不存在相关性。并且，对于长期接受NAs治疗、HBsAg处于较低水平的CHB患者，血清HBV RNA水平与HBsAg定量相关性也逐渐消失，但血清HBV RNA与核心抗原相关抗原始终保持着较好的相关性。
需要强调的是，在接受PEG-IFN治疗的CHB患者中血清HBV RNA与HBV DNA在治疗过程中始终具有良好的相关性。
4 血清HBV RNA可反映肝组织内cccDNA的活性或状态
HBV cccDNA的持续存在是导致HBV感染慢性化、CHB久治不愈和停药后容易复发的主要原因。因此，肝组织内cccDNA清除是判定HBV感染彻底治愈的一项重要指标。然而，临床上以cccDNA检测为目的的肝穿刺活组织检查难以普遍开展。因此，在无法直接精确检测肝组织内cccDNA及其活性的情况下，探索能够反映肝组织内cccDNA活性的替代血清学指标具有十分重要的意义。
Giersch等利用HBV感染的人肝嵌合小鼠进行的研究发现，血清HBV RNA水平与肝组织内cccDNA的水平呈正相关（r=0.89，P＜0.0001）。笔者的研究进一步发现，在未经抗病毒治疗的HBeAg阳性HBV感染者中血清HBV RNA水平与肝组织内cccDNA的水平具有相关性（r=0.39，P=0.002），但这种定量相关性在HBeAg阴性HBV感染者中消失（r=0.10，P=0.654）。
与Giersch等使用人源化小鼠模型的研究结果（r=0.89）相比，笔者的研究在HBeAg阳性HBV感染者分析得出的血清HBV RNA和肝内cccDNA的相关性相对较弱（r=0.39），这种差异可能与病毒变异的积累和宿主遗传背景的多样性有关。
此外，Wang等研究发现未经抗病毒治疗的CHB患者血清HBV RNA的水平不仅与肝组织中cccDNA的水平相关，而且与其转录活性（HBV RNA/cccDNA）具有显著的相关性。然而，笔者的前期研究发现，尽管CHB患者经NAs治疗后血清HBV RNA 水平与肝组织内cccDNA的水平在定量关系上无相关性，但血清HBV RNA检测阳性与否仍可反映肝组织内cccDNA的状态，如在41例长期接受NAs治疗的CHB患者中，20例血清HBV RNA阳性的CHB患者其肝组织内cccDNA均阳性，9例肝组织内cccDNA低于检测下限的CHB患者中血清HBV RNA均低于检测下限，但在12例肝组织内cccDNA阳性的CHB患者血清中HBV RNA低于检测下限。该研究结果提示，在排除检测灵敏度的情况下，如果血清HBV RNA阳性则反映肝组织内存在cccDNA，并处于转录活跃状态；如果血清HBV RNA检测不到则反映肝组织内cccDNA消失，或者尽管其肝组织内cccDNA存在，但处于转录沉默状态。由此可见，在经NAs治疗的CHB患者中，虽然血清HBV RNA水平与肝组织内cccDNA的水平无相关性，但可反映肝组织内cccDNA的状态。
此外，笔者的前期研究还发现，反映HBV DNA聚合酶（p蛋白）逆转录活性的血清HBV RNA/HBV DNA比值在不同自然史的慢性HBV感染者中存在显著差异，据此认为，HBV DNA和HBV RNA的总体水平更能准确反映肝组织内cccDNA的水平及其转录活性。由于NAs不直接影响HBV RNA的生成，并且3.5 kb的pgRNA仅能来自于cccDNA的转录，所以血清HBV RNA可作为反映肝组织内cccDNA活性或状态的替代血清学指标。
5 血清HBV RNA可用于评价抗病毒药物的疗效
已有多项研究证实血清HBV RNA可用于评价NAs抗病毒治疗的疗效。Huang等通过分析52例接受拉米夫定或恩替卡韦治疗的CHB患者在治疗前、治疗12周和24周时的血清HBV RNA水平，发现在治疗12周时血清HBV RNA水平越低，CHB患者越容易在24周时实现HBV DNA阴转，表明血清HBV RNA水平可预测CHB患者经NAs治疗的病毒学应答。
van Bömmel等通过分析50例接受NAs治疗的HBeAg阳性CHB患者，发现HBeAg阴转的患者中血清HBV RNA水平从基线至治疗3、6个月的下降幅度分别显著高于未发生HBeAg血清学转换的患者。同时，与血清HBV DNA、HBsAg、ALT、HBV基因型、年龄和性别相比，血清HBV RNA水平的下降幅度是预测HBeAg血清学转换的最佳血清学标志物。
同样，Luo等研究发现获得病毒学应答的CHB患者在恩替卡韦治疗期间血清HBV RNA水平的下降幅度显著高于未获得病毒学应答的患者，并且血清HBV RNA水平在治疗基线 ＜ 4.12 log10 拷贝/ml的CHB患者更容易发生HBeAg血清学转换。此外，监测血清HBV RNA水平还可预测经拉米夫定治疗的CHB患者出现病毒耐药突变的风险。
此外，Wang等研究发现血清HBV RNA水平与肝脏炎症程度评分（r=0.665，P＜0.001）及纤维化程度评分（r=0.722，P＜0.001）均具有相关性，提示检测血清HBV RNA水平可预测CHB患者经NAs治疗后的肝组织学改善。
监测血清HBV RNA水平还可预测CHB患者PEG-IFN治疗的疗效。Jansen等研究发现NAs联合PEG-IFN治疗的CHB患者，其血清HBV RNA水平的下降幅度显著高于NAs单药治疗的患者，并且在HBeAg阴性CHB患者中基线时较低的血清HBV RNA水平与病毒学应答独立相关。同样，van Bömmel等研究也发现CHB患者在接受PEG-IFN治疗过程中，其血清HBV RNA水平的动态变化可预测病毒学应答的发生情况，对于预期应答不佳的患者应尽早更换抗病毒方案，使患者获得最佳的治疗效果。
目前多家企业及科研单位正在开发针对HBV生命周期不同阶段的新型抗病毒药物，包括病毒与细胞受体结合抑制剂、新的病毒聚合酶抑制剂、衣壳装配抑制剂、病毒释放阻滞剂，以及cccDNA形成和转录抑制剂等。除了这些直接抗病毒药物外，还在研发包括Toll样受体激动剂、检查点抑制剂和治疗性疫苗在内的增强抗HBV特异性免疫反应的药物。血清HBV RNA在目前的新药研发过程中已经成为评价药物抗病毒疗效的一个重要血清学指标，并已写入美国食品药品管理局关于抗HBV新药申报的指导意见中。
6 血清HBV RNA可预测NAs治疗停药后发生病毒学反弹的风险
NAs主要通过抑制HBV DNA的合成发挥抗病毒作用，患者的血清HBV DNA在用药后可很快低于检测下限。但此类药物对cccDNA并无直接作用，停药后易出现病毒学反弹甚至疾病复发。因此，各国（地区）的CHB管理指南中均强调接受NAs治疗的CHB患者需要进行长期治疗，同时也对巩固治疗后的停药提出了建议。
Tsuge等通过小样本的回顾性临床研究发现停药点血清HBV RNA 未检出的患者发生病毒学反弹的风险明显下降。笔者在前期研究中也发现，21例停药点HBV RNA阳性的CHB患者在停药后24周全部出现病毒反弹（100%），而12例停药点HBV RNA低于检测下限的CHB患者中仅有3例（25%）出现病毒反弹（P＜0.05），结果表明当血清中HBV RNA阳性时预示着停药后发生病毒反弹和疾病复发的风险较高。
此外，笔者在32例接受PEG-IFN单独治疗或联合NAs治疗后实现血清HBsAg和HBV DNA均消失的CHB患者中发现，7例血清HBV RNA阳性的患者在停用PEG-IFN后均发生了HBsAg和（或）HBV DNA阳转，而在25例血清HBV RNA检测不到的患者中只有5例在停用PEG-IFN后发生了HBsAg和（或）HBV DNA阳转。这一结果表明，监测血清HBV RNA水平也可预测经抗病毒治疗后实现HBsAg消失暨“临床治愈”的CHB患者出现病毒反弹的风险。由于上述研究都是基于单中心的小样本回顾性队列研究，未来仍需多中心的大样本前瞻性研究加以验证。
7 基于血清HBV RNA检测的CHB临床治愈精准路径
传统的病毒学应答是基于血清HBV DNA水平定义的，然而，由于NAs 治疗可直接高效阻断HBV rcDNA的生成，但并不直接影响pgRNA的生成，因此临床上会出现经NAs治疗的CHB患者中血清HBV DNA很快消失，而相当一部分患者的血清HBV RNA仍持续阳性的情况。血清HBV RNA阳性表明患者肝组织内仍存在转录活跃的cccDNA。为了更加准确的评估抗病毒效果，笔者建议病毒学应答的检测应该纳入血清HBV RNA的检测，并应重新定义为血清HBV DNA和HBV RNA均持续消失（低于检测下限）。
此外，笔者团队以HBV RNA检测为基础修订了“部分治愈”（partial cure）和“准临床治愈”（para-functional cure）的概念；其中修订的“部分治愈”指的是CHB患者经抗病毒治疗后ALT恢复正常，血清HBV DNA和HBV RNA持续低于检测下限，而此时的血清HBsAg水平仍较高；“准临床治愈”指的是在“部分治愈”的基础上肝组织内cccDNA已清除或处于持续的表达静默状态，但由于整合的病毒DNA片段可以持续低水平表达HBsAg，患者血清HBsAg仍可有低值阳性。
以“准临床治愈”为基础，笔者对CHB的抗病毒治疗提出了优化治疗路径的建议，其中建议对未达到“准临床治愈”的CHB患者继续进行NAs治疗或联合PEG-IFN治疗，达到“准临床治愈”后则可以考虑停止NAs用药，并进行PEG-IFN的序贯治疗，以期能够使更多的CHB患者实现临床治愈。通过CHB抗病毒治疗阶梯式“治愈”的建议，期望有助于推动CHB临床治愈的精准治疗路径，最终有助于更多的CHB患者实现临床治愈。
随着血清HBV RNA的来源、性质，及其临床意义被逐渐阐明，该指标逐渐为大家所认识和重视，未来血清HBV RNA可能作为CHB患者经抗病毒治疗实现血清HBV DNA消失后，反映抗病毒疗效和肝组织内cccDNA活性或状态的补充指标。然而，目前国内乃至国际上尚无商品化的检测试剂。据悉国际诊断行业的一些著名公司已开展血清HBV RNA诊断试剂的研发，我国也应该加快相关试剂的研发和审批，使其早日应用于临床。